多克隆抗体的制备（免疫学检验技术课件）

多克隆抗体的制备免疫学检验技术教学培训课件—*—多克隆抗体的制备抗血清/免疫血清/PcAb概念天然抗原常含有多种抗原决定簇，可刺激动物体内多个B细胞克隆针对该抗原的多种抗原决定簇产生不同的抗体，称为多克隆抗体（PcAb）。将抗原以不同途径免疫动物，可从动物血清中分离得到抗体，因而把这类含有抗体的血清称为抗血清或免疫血清。—*—情景设计多克隆抗体的制备假设现在需要提取鸡肝细胞里面的A蛋白（500KD），配成一定浓度作为抗原，从给定的三种动物（鸭、兔、山羊）中选择合适的动物在实验室里免疫，一段时间后采血，分离血清，若得到抗体，从中提取出Ab1，并鉴定其效价和纯度，最后选一个最好的方法保存起来。步骤：制备可溶性抗原（鸡A蛋白）→免疫动物→采血→提取、纯化、鉴定Ab1→保存Ab1—*—提问多克隆抗体的制备现准备了三种动物，分别是鸭、兔和山羊，在4楼实验室里用于免疫从鸡肝细胞内提取的A蛋白，主要用于验证抗原刺激动物的免疫系统可产生抗体的特性，选哪一种动物好呢？—*—提问多克隆抗体的制备1）如果这里分别有小兔子、大兔子、老兔子，选哪一种好呢？2）这里有活泼可爱、毛色发亮的健康大兔子，也有流鼻涕又拉稀的大兔子，选哪一种好呢？3）健康的雄兔子和健康的雌兔子，最好选哪一种？答案：大兔子；活泼可爱、毛色发亮；健康的雄兔子。—*—多克隆抗体的制备免疫动物选择（1）种类：家兔、豚鼠、绵羊、马、鸡、山羊等；（2）Ag与免疫动物种系差异越大，效果越好；（3）动物个体适龄（体重符合要求）、健壮、无感染性疾病（宜雄性）；（4）选用多只条件相同的动物同时进行免疫；—*—多克隆抗体的制备免疫动物选择（5）抗原的性质：适宜（蛋白质→家兔、山羊/类固醇激素→家兔/酶类→豚鼠）；不适宜（IgE→绵羊/多种酶→山羊/胰岛素→家兔）；（6）抗血清的要求：R型（兔型）→等价带宽→诊断试剂/H型（马型）→等价带窄→治疗试剂；抗体数量需求多→大动物—*—多克隆抗体的制备按设计的方案免疫（1）免疫量：在一定范围内，越大越好；（2）免疫途径：皮内（初次免疫）、皮下、肌肉、静脉（加强免疫）、腹腔、淋巴结（抗原量少、珍贵）、脚掌等；（3）免疫时间间隔：第1次与第2次→10-20d；第2次之后→7-10d。—*—多克隆抗体的制备动物采血（1）时间：动物免疫3～5次后，可取少量血清检测抗体效价与特异性，测试合格后，应在末次免疫后5～7d及时采血分离血清，采血前动物禁食24h。—*—多克隆抗体的制备动物采血（2）方法：1）心脏采血法：小动物；2）颈动脉放血法：最常用的方法；3）静脉采血法：可多次采；4）其他方法：摘除眼球、断尾。—*—多克隆抗体的制备抗血清分离/纯化（1）抗血清分离：血液自然凝固，分离血清。（2）抗血清纯化：1）IgG类抗体的纯化：盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析。2）特异性抗体的纯化：亲和层析法、吸附剂方法。—*—设计情景提问多克隆抗体的制备如免疫抗原有5种（4种杂质Ag）：Ag1、Ag2、Ag3、Ag4和Ag5，免疫后产生5种抗体：Ab1、Ab2、Ab3、Ab4和Ab5，现需分离出Ab1，怎样分离？方法1：亲和层析法动画：亲和层析法纯化特异性抗体—*—设计情景提问多克隆抗体的制备如免疫抗原有5种（4种杂质Ag）：Ag1、Ag2、Ag3、Ag4和Ag5，免疫后产生5种抗体：Ab1、Ab2、Ab3、Ab4和Ab5，现需分离出Ab1，怎样分离？方法2：吸附剂方法动画：吸附法纯化特异性抗体—*—多克隆抗体的制备抗血清鉴定（1）效价：放射免疫法/凝集反应/双扩（举例）等。（2）特异性：双扩等。（3）纯度：电泳等。（4）亲和力：酶联免疫吸附试验（ELISA）等。—*—提问多克隆抗体的制备根据下图回答：此抗原为颗粒性抗原还是可溶性抗原？抗体的效价是多少？答案：可溶性抗原；效价为1：8—*—提问多克隆抗体的制备根据下面的双扩图结果判断：抗体是否纯化成功？答案：纯化不成功—*—提问多克隆抗体的制备现得到PcAb100mL，需要将其保存起来，每次使用5mL，请问是100mL一起保存还是分装为5mL小袋保存？为什么？保存方法有几种？答案：小袋分装；反复冻融影响抗