临床血液学检验：细胞化学染色检验

第二节细胞化学染色检验为什么要做组织化学染色火眼金睛能辨认出什么细胞？原始淋巴细胞？原始单核细胞？原始粒细胞？其它肿瘤细胞？

细胞化学(或组织化学)是组织学的一个分支，是在细胞形态学的基础上研究细胞的生物化学成分、定位、定量及代谢功能状态的学科。细胞化学染色

CytochemicalStaining实质是原位显示细胞成分结构，为不移动有机化学物。细胞化学染色包括三个步骤：固定有色沉淀反应复染细胞化学染色的基本步骤固定（fixation）物理法：干燥、火焰化学法：液体固定(甲醛、乙醇、甲醇、丙酮)显示(display)：通过化学反应形成有色沉淀显示被测物质。偶氮偶联法联苯胺法普鲁士蓝法雪夫反应金属沉淀法保持细胞结构及化学成分的不变使细胞内的蛋白质、酶类、糖类等变成不溶性物质。细胞化学染色的基本步骤复染(doublestaining)复染颜色应与有色沉淀的颜色有明显对比。化学定量（chemicalquantitativeanalysis）定性半定量定量铁染色中性粒细胞碱性磷酸酶染色过氧化物酶染色苏丹黑染色过碘酸-雪夫反应酯酶染色酸性磷酸酶染色普鲁士兰染色法（1958郁知非方法）1.原理:根据BM中含Fe3+与蛋白质结合较疏松，经稀HCL处理后，呈游离Fe3+。在酸性溶液中与亚铁氰化钾作用后呈兰绿色，有折光，圆形颗粒或珠、块状。

4Fe++++3K4[Fe(CN)6]Fe4[Fe(CN)6]3

一、铁染色贮存铁（铁蛋白+含铁血黄素），主要分布网状细胞内。细胞外铁骨髓小粒

幼稚红细胞的非血红素含铁颗粒，又称铁粒幼红细胞。分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和环形铁粒幼红细胞细胞内铁少数含小颗粒的正常成熟红细胞称铁粒红细胞铁粒红细胞2.铁染色分类细胞外铁细胞内铁铁粒红细胞3.正常范围细胞外铁：

+～++细胞内铁：

12～44%4.临床意义⑴缺铁性贫血（IDA）---诊断IDA及指导铁剂治疗的一种辅助方法。⑵铁粒幼细胞贫血---环形铁粒幼红细胞增多⑶MDS---环形铁粒幼红细胞＞15%，外铁↑⑷非缺铁性贫血：HA、MegA、AA、多次输血、白血病等，内外铁N/↑；感染、肝硬化、尿毒症等，外铁↑内铁↓缺铁性贫血（IDA）巨幼红细胞性贫血

内铁颗粒多MDS-RA、RAEB、RAEBT铁染色

N/↓/↑

环形铁粒幼细胞（RS）大于15%---RAS诊断铁染色中性粒细胞碱性磷酸酶染色过氧化物酶染色苏丹黑染色过碘酸-雪夫反应酯酶染色酸性磷酸酶染色

血细胞含有的磷酸水解酶主要

碱性磷酸酶ALP

酸性磷酸酶ACP

ALP由许多同工酶组成，在碱性条件下(最适pH为9.3～9.6)催化各种醇和酚的单磷酸酯。二、碱性磷酸酶染色钙钴法Gomori-Takamaish偶氮偶联法底物:磷酸萘酚AS-MXTomonaga1963

萘酚AS-BI磷酸钠Kaplow1963α-磷酸萘酚钠重氮盐:坚固蓝B固兰RR固紫B盐1.染色方法

Kaplow法中性粒细胞中的碱性磷酸酶在pH9.6水解磷酸萘酚钠，释放萘酚，后者与偶氮盐耦合形成不溶性的染料。

2.染色原理ALP偶氮偶联法原理阳性：中性粒细胞的标志酶，ALP的含量以晚幼和成熟粒细胞为最高,原粒ALP反应阴性；网状细胞强阳性。阴性：嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨核细胞、浆细胞及红系细胞。3.分布4.染色分级反应(-)0分：阴性反应，胞浆中无阳性染色颗粒。(+)1分：胞浆少量颗粒或呈弥散浅红色。(++)2分：胞浆中含有中等量颗粒或弥散受色。(+++)3分：胞浆中有丰富的颗粒或弥散深色，胞核清晰。(++++)4分：极丰富粗大颗粒，或弥散深色，胞核不清晰。NAP积分：NAP反应结果（%）（-）（+）（++）（+++）（++++）

204020155积分=（0×20）+（1×40）+（2×20）+（3×15）+（4×5）=145阳性率为80%。细菌感染ALP染色CMLALP阴性5.ALP正常范围阳性率:〈40%阳性指数:30～130分⑴生理变化年龄：NAP活性在新生儿很高，3个月开始降低，婴幼儿和儿童期仍略高于成年人，60岁以上老年期NAP活性降低。应激状态：恐惧、紧张、妊娠、分娩和剧烈运动等应激状态下NAP活性可增高。性别：女性＞男性；经前期＞行经期6.临床意义⑵病理变化：炎症反应，各种急性化脓性感染，球菌性较杆菌性感染为高；急性感染较慢性感染高。病毒性感染或寄生虫感染、立克次体感染时ALP积分值一般正常或降低。类白血病与CML鉴别：前者中性粒细胞ALP表现极度增高，CML减低。ALP增高

急淋、慢淋、多发性骨髓瘤、原始神经母细胞瘤、再障、真性红细胞增多症、骨髓纤维化、慢性中性粒细胞白血病、恶性淋巴瘤、骨髓转移癌、原发性血小板增多症等。

ALP降低慢粒、恶性组织细胞病、急性髓系白血病阵发性睡眠性血红蛋白尿。MDS正常或减低。

增高减低类白血病慢性粒细胞白血病慢性中性粒细胞白血病慢性粒细胞白血病细菌感染病毒感染再生障碍性贫血PNH

正常减低反应性组织细胞增多症恶性组织细胞病

正常增高

继发性红细胞增多症真性红细胞增多症继发性血小板增多症原发性血小板增多症ALP鉴别意义铁染色中性粒细胞碱性磷酸酶染色过氧化物酶染色苏丹黑染色过碘酸-雪夫反应酯酶染色酸性磷酸酶染色1.实验方法

1958年Washburn复方联苯胺法

1965年Kaplow二盐酸联苯胺法

1985年血液学国际标准化委员会(ICSH)

二氨基联苯胺法（DAB染色法）过氧化酶氨基-甲基卡巴唑染色法二盐酸联苯胺法三、过氧化物酶染色PeroxidaseStaining(POX)2.染色原理过氧化氢新生态氧过氧化物酶二氨基联苯胺DBA金黄色沉淀二氨基联苯胺法二盐酸联苯胺法

3.血细胞阳性程度的判断：（-）无颗粒沉着（±）颗粒细小，分布稀疏（+）颗粒较粗常呈局灶性分布（++）颗粒粗大分布较密占胞浆1/2～2/3（+++）颗粒粗大，呈团块状分布（++++）颗粒布满细胞，可覆盖胞核4.参考范围⑴粒细胞系

原粒-/±，粗粒聚集状；随细胞成熟反应渐强；衰老细胞因过氧化酶活性降低而反应减弱;嗜酸粒细胞为强阳性反应;嗜碱粒细胞呈阴性或弱阳性反应。⑵其它细胞成熟单核细胞、组织细胞呈-或±；幼红细胞、淋巴细胞、浆细胞、巨核细胞及血小板均为阴性反应。5.MPO临床意义POX主要存在于线粒体和溶酶体中，定位于中性粒细胞和单核细胞嗜天青颗粒中。急性白血病MPO反应强弱顺序

M3>M2b>M2a>M6(粒)>M4>M1>M5>HAL>ALLALL和AML鉴别：ALLMPO阴性ALLL1L2L3AMLM0急性髓细胞白血病微分化型

M1急性原始粒细胞白血病未分化型

M2—M2a,M2b急性原始粒细胞白血病部分分化型M3—M3a,M3b急性早幼粒细胞白血病M4—M4a,M4b,M4c,M4Eos急性粒-单核细胞白血病M5—M5a,M5b急性单核细胞白血病M6急性红白血病

M7急性巨核细胞白血病

急性白血病的FAB分型急性淋巴细胞白血病MPO阴性

急性混合型白血病MPO急性髓细胞白血病MPO特点粒系MPO：阳性反应物颗粒粗大，聚集。单核系MPO：阳性反应物细颗粒状，弥散

早幼粒以下随细胞分化成熟而↑；

特点：阳性物在细胞核的凹陷处聚集成团，呈团块状反应。

M2b中异常中幼粒细胞MPO呈强阳性

特点：阳性物充满胞浆，细胞外浆一般为阴性。

M3呈强阳性反应。M4MPO染色M5MPO染色急淋ALL急粒AML急单AMOL急粒APL铁染色中性粒细胞碱性磷酸酶染色过氧化物酶染色苏丹黑染色过碘酸-雪夫反应酯酶染色酸性磷酸酶染色铁染色中性粒细胞碱性磷酸酶染色过氧化物酶染色苏丹黑染色过碘酸-雪夫反应酯酶染色酸性磷酸酶染色periodicacid-schiff，PAS

又名糖原染色五、过碘酸-雪夫反应1.原理：氧化剂过碘酸把-CHOH-CHOH变成-CHO-CHO，此新生的醛基与无色碱性品红染液（schiff）结合成紫色染料，其反应颜色的深浅于细胞内乙二醇基的含量成正比。

2.阳性结果

阳性结果为胞质内出现粉红色物质。细胞核为蓝色。

颗粒状片状珠状块状

阳性率：100个计数细胞中阳性细胞的个数阳性指数：100个细胞中阳性细胞，按不同强度的细胞个数乘以相对应强度之和。例：（+）×1+（++）×2+

（+++）×3+（++++）×4阳性率及阳性指数计算法细颗粒弥散状

PAS为裙边样反应细颗粒弥散状见小珠

中粗颗粒散在分布PAS珠状、块状呈冠状。

3.正常血细胞染色反应⑴粒细胞系原粒细胞多呈（±），少部分见（-）。随细胞的成熟阳性反应渐强；嗜酸粒细胞颗粒本身不着色，但颗粒间的胞浆呈弥漫粉红色；嗜碱粒细胞为阳性，反应物呈粗颗粒、珠状和块状。⑵淋巴细胞系大多数呈（-）少数胞质内有少量红色颗粒B淋巴细胞PAS正常值为阳性率＜20%⑶红细胞系幼红细胞和成熟红细胞均呈（-）。⑷巨核细胞系和血小板

（-）或（+）阳性物呈珠状或块状

⑸单核细胞呈（+），阳性反应物为细颗粒弥散状、中粗颗粒往往位于胞浆边缘；

⑹浆细胞大多呈（-），少数为红色颗粒；

⑺组织细胞为（-）/（+）；

⑻巨噬细胞可呈细颗粒（+）。4.临床意义⑴白细胞系统疾病的鉴别①原幼淋细胞：阴性阳性细、中粗和粗颗粒散在分布；珠状和块状一个至数个成冠。②成熟淋巴细胞细、中粗、粗颗粒散在分布。

ALLPAS(-)

中粗、粗颗粒散在分布

ALLPAS珠状③原粒及早幼粒细胞阴性或弱阳性细颗粒弥散状

M2bPAS细颗粒弥散状

M3④原、幼稚单核细胞阳性较粒细胞强细、中粗颗粒弥散状分布，边缘及外浆处可见粗颗粒。部分在细颗粒基础上可见小珠；少数呈裙边样反应。⑤嗜碱粒细胞PAS为强阳性，

阳性物多表现粗颗粒、珠状、块状。⑵红细胞系统阴性：正常人和再障。阴性：正常红细胞、AA、CLL弱阳性：巨幼贫、溶血性贫血强阳性：红白血病及各类急性白血病的幼红细胞、MDS、IDA和重型地中海贫血。

IDAPAS

MDSPAS染色M6PAS染色铁染色中性粒细胞碱性磷酸酶染色过氧化物酶染色苏丹黑染色过碘酸-雪夫反应酯酶染色酸性磷酸酶染色(Esterase)㈠酯酶分类⒈特异性酯酶:氯乙酸萘酚AS-D酯酶(NaphtholAS-Dchloroacetateesterase，NAS-DCE)⒉非特异性酯酶α-醋酸萘酯酶(Alpha-naphtholacltateesterase,α-NAE)醋酸AS-D萘酚酯酶(NaphtholAS-Dacltateasterase,NAS-DAE)α-丁酸萘酯酶(Alpha-Naphtholbutynateasterase,α-NBE)六、酯酶染色

国际血细胞标准化委员会1985年

固紫酱GBC法

新品红方法特异性酯酶染色方法介绍1.特异性酯酶CE染色原理

细胞内的氯乙酸萘酚酯酶，在作用液中可以将氯乙酸AS-D萘酚进行水解，释放氯乙酸AS-D与重氮盐偶联产生不溶性有色沉淀，定位于胞质内。

CE通常被看成是粒细胞及肥大细胞的标志酶，分布局限，对粒细胞有较强的特异性。CE固紫酱GBC法

CE副品红方法

2.正常血细胞染色反应⑴粒系原粒细胞呈阴性反应分化好早幼粒细胞至成熟中性粒呈阳性反应;

嗜酸粒细胞呈阴性或弱阳性反应;

嗜碱粒细胞呈阴性反应。⑵单核细胞呈阴性或弱阳性反应。⑶淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞、巨核细胞和血小板均呈阴性反应。⑷组织嗜碱细胞呈强阳性反应。

3.临床意义急性白血病，阳性率强弱的排列顺序为：

M3>M2b>M5>M2a>M4>M6（粒）>Ml>ALL

粒系原始及早幼粒细胞一般阴性，少部分可见弱阳性反应(+～++)。

M2b在细胞核的凹陷处呈团块状反应M3呈强阳性反应。易见柴束样结晶。

单核：阴性或弱阳性，为颗粒状散状分布

ALLCE染色阴性

(Non-SpecificEsterase)

非特异性酯酶是一组在酸性、中性和碱性pH条件下，水解各种短链脂肪酸酯或芳香族酯的酶。几乎存在于所有血细胞，包括巨核细胞、浆细胞，甚至上皮细胞的溶酶体内。该酶是单核细胞、巨噬细胞的标志酶,分布较广泛。非特异性酯酶底物：α-醋酸萘酚酯酶(α-NAE)

醋酸AS-D萘酚酯酶(NAS-DAE)

α-丁酸萘酚酯酶(α-NBE)

重氮盐坚牢蓝B固蓝BB六偶氮付品红

α-醋酸萘酚酯酶

α-Naphtholacetateesterase，α-NAE

1.原理:

在中性条件下，酯酶将醋酸萘酚水解，产生萘酚，在与重氮盐偶联，产生不溶性的有色沉淀。

不加NaF积分值-加NaF积分值NaF抑制率

=——————————————×100％

不加NaF积分值

抑制率大于50％为抑制

NaF用量15mg／10m1作用液。2.正常血细胞染色反应⑴粒细胞系:各阶段粒细胞均为-或±，随细胞成熟阳性减弱呈阴性，不被氟化钠抑制⑵单核细胞:阳性反应较强,能被氟化钠抑制。⑶其它细胞成熟淋巴细胞部分呈阳性反应，阳性物多表现为颗粒状，不被氟化钠抑制；巨核细胞和血小板呈强阳性反应；早期幼红细胞呈阳性反应，随幼红细胞的成熟阳性反应逐渐减弱，不被氟化钠抑制。NAE正常参考结果

3.临床意义是单核细胞和巨噬细胞的标志酶

⑴单核细胞系统疾病原始单核细胞呈阳性，阳性细胞呈局灶型或颗粒型反应；少部分为阴性。幼稚单核细胞阴性、弱阳性和强阳性。阳性物颜色鲜艳呈细小颗粒弥散状加NaF后阳性率及指数明显降低或阴性。原幼单核细胞NAE染色M5NAE+NaF染色⑵粒系统细胞疾病原始及早幼粒细胞阴性或弱阳性反应，酶型多为弥散型、局灶型，少数可呈颗粒状。阳性反应不被NaF抑制。M2aNAE染色M2bNAE染色⑶淋巴细胞疾病阴性或阳性，阳性物可呈颗粒型或局灶型，在pH5.0条件下，T-淋巴细胞NSE活性显示更为充分。有利于ALL和ANLL的鉴别。ALLNAE染色铁染色中性粒细胞碱性磷酸酶染色过氧化物酶染色苏丹黑染色过碘酸-雪夫反应酯酶染色酸性磷酸酶染色

酸性磷酸酶染色法(ACP)

存在大部分有核细胞的胞质，共有7种同功酶，在临床血液学上，酸性磷酸酶反应对诊断HCL，鉴别T-细胞型和非T细胞型淋巴增生有重要意义。是HCL所特有的，HCLACP呈阳性反应，阳性为中等强度或强阳性反应，并具有抗L（+）-酒石酸的功能。

T-ALLACP

B-ALLACP铁染色中性粒细胞碱性磷酸酶染色（N-ALP）过氧化物酶染色（POX）苏丹黑染色（SBB）糖原染色（PAS）特异性酯酶（CE）非特异性酯酶（N