临床微生物学检验：3细菌生化反应

概念：不同细菌所具有的酶系统各不相同，对营养物质的利用能力各异，它们在代谢过程中所产生的代谢产物也不同，利用生物化学方法直接或间接检测细菌的代谢产物，从而鉴别细菌的反应称之为细菌生化反应。学习目标：

掌握每个生化试验原理及结果观察！2023/3/91细菌的生物化学鉴定技术生化反应分类碳水化合物的代谢试验蛋白质和氨基酸的代谢试验碳源和氮源利用试验呼吸酶类试验其他生化试验2023/3/93细菌的生物化学鉴定技术（一）碳水化合物的代谢试验1.糖（苷、醇）类发酵试验作用：是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要2023/3/94原理：酶不分解（－）糖（苷、醇）产酸不产气（＋）产酸产气＋常用糖（苷、醇）类底物：单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖等双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖等多糖：淀粉、糊精、肝糖等醇类：甘露醇、卫矛醇、山梨醇等苷类：七叶苷、水杨素等常用指示剂及颜色变化

pH域

酸色碱色酚红6.8--8.4黄

红溴麝香草酚蓝6.0--7.6黄

蓝溴甲酚紫5.2--6.8黄

紫甲基红4.2--6.2红

黄中性红6.8--8.0红

黄2023/3/96指示剂：溴甲酚紫酸性：黄色碱性：紫色指示剂：酚红酸性：黄色碱性：红色结果：2023/3/972．氧化―发酵试验（O/F试验）作用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。2023/3/98原理：有些细菌仅能在有氧的情况下分解

葡萄糖（氧化型）

有些细菌在有氧无氧的情况下都可

以分解葡萄糖（发酵型）

有些细菌在有氧无氧的情况下都不

分解葡萄糖（产碱型）结果：氧化发酵产碱

注意：需加无菌石蜡油隔绝空气！

2023/3/99指示剂为溴甲酚紫或溴麝香草酚兰2023/3/9103．β―半乳糖苷酶试验（ONPG试验）迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验均为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本试验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。2023/3/911细菌正常分解乳糖必需具备半乳糖苷渗透酶

(主动运输乳糖，乳糖进入细胞速度快）和-半乳糖苷酶（分解乳糖）。

迟缓发酵乳糖的细菌因为仅有-半乳糖苷酶，没有半乳糖苷渗透酶，所以乳糖进入细胞只能依靠被动渗入，速度慢，表现为发酵乳糖的速度也很慢。原理：-半乳糖苷酶试验是用邻硝基酚半乳糖苷（ONPG，本身无色）代替乳糖，由于其分子量小，不需要半乳糖渗透酶就可直接快速进入菌细胞，被-半乳糖苷酶水解后生成黄色的邻－硝基酚，可快速检测细菌是否具有-半乳糖苷酶（即细菌能否发酵乳糖）。结果：黄色（+）2023/3/912细菌正常利用乳糖一般需要两个酶：促使乳糖进入细菌的半乳糖苷透过酶(galactosidepermease)和催化乳糖分解第一步的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)。2023/3/9ONPG(+)(-)

-

-

+4.七叶苷水解试验(esculintest)

＋－七叶苷pH<7β-D-葡萄糖七叶素黑色沉淀

(柠檬酸铁)

应用：D群链球菌和肠球菌的鉴定。2023/3/9155、甲基红试验（MR试验）、VP试验

原理：

葡萄糖

丙酮酸

乙酰甲基甲醇混合酸

KOH+空气氧化

二乙酰pH4.5

-奈酚（+胍基）

甲基红指示剂

红色化合物

红色（VP试验阳性）

(甲基红试验阳性)

结果：红色为阳性

培养基：葡萄糖蛋白胨水

注意：两种试验看结果前均需加试剂！MR试验（－）

（＋）葡萄糖甲基红试剂丙酮酸甲酸，乙酸等大量混合酸pH降至4.5以下培养基变红甲基红试验

MethylRedVP试验（－）

（＋）葡萄糖二乙酰V-P试剂

(KOH+α-萘酚)脱羧丙酮酸乙酰甲基甲醇培养基变红VP试验

Voges-ProskauerTest

2023/3/918（二）蛋白质和氨基酸的代谢试验1．吲哚(靛基质)试验

注意：观察结果前需加吲哚试剂！色氨酸酶色氨酸对二甲基氨基苯甲醛靛基质（吲哚）玫瑰吲哚吲哚(-)(+)吲哚(靛基质)试验(Indoletest)原理主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。培养基：醋酸铅培养基

应用：主要用于肠杆菌科中属及种鉴别2.硫化氢试验原理-+含硫氨基酸(胱氨酸等)硫化氢黑色沉淀分解

Fe2+/Pb2+

2023/3/9213.尿素分解试验(Ureasetest)主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。

-+尿素尿素酶氨+CO2培养基变红色pH酚红2023/3/923尿素分解试验（指示剂为酚红）（－）（＋）4.苯丙氨酸脱氨酶试验（phenylalaninedeaminasetest）主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、普罗菲登斯菌属和摩根菌属细菌均为阳性，肠杆菌科中其他细菌均为阴性。苯丙氨酸苯丙氨酸脱氨酶苯丙酮酸10％三氯化铁绿色化合物＋

－5.氨基酸脱羧酶试验(aminoaciddecarboxylationtest)

应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。＋

－氨基酸(鸟氨酸，赖氨酸，精氨酸）pH（）脱羧酶胺（腐胺，尸胺，精胺）

+CO2培养基变紫或红色溴甲酚紫或酚红＋

－2023/3/9262023/3/927（三）碳源和氮源利用试验枸橼酸盐利用试验应用：用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。原理：有些细菌能利用枸橼酸盐作为唯一的碳源获得能量也能利用铵盐作为唯一的氮源，同时生成氨，使培养基碱化。结果：指示剂为溴麝香草酚兰2023/3/928（＋）（－）枸橼酸盐利用试验

（－）（＋）

细胞色素氧化酶参与的细菌呼吸途径中电子传递1.氧化酶试验（Cytochromeoxidasetest）（四）呼吸酶类试验细胞色素C细胞色素氧化酶氧化的细胞色素C二甲基对苯二胺（还原）四甲基对苯二胺（还原）无色无色二甲基对苯二胺（氧化）四甲基对苯二胺（氧化）蓝色红色应用：主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别。间接法直接法氧化酶试验（Cytochromeoxidasetest）结果试管法玻片法2.过氧化氢酶（触酶）试验(Catalasetest)应用：用于革兰阳性球菌的初步分群。触酶H2O2H2O出现气泡+O23.硝酸盐还原试验(Nitratereductiontest)原理

对氨基苯磺酸-萘胺-萘胺偶氮苯磺酸亚硝酸盐2023/3/933原理：有些菌可还原硝酸盐为亚硝酸盐或氨和氮等，前者可与-萘胺和对氨基苯磺酸反应，生成红色偶氮化合物。硝酸盐还原试验就是测定还原过程中所产生的亚硝酸盐。

结果：立即出现红色为阳性；若没有红色出现，原因可能为：①真正阴性，可加锌粉于阴性反应物中，变成红色，为真正阴性；②或假阴性（真阳性），加锌粉不变色，因生成的亚硝酸盐被进一步还原成NH3、N2

等。

锌硝酸盐亚硝酸盐硝酸盐没有被还原硝酸盐还原试验(几种结果演示)硝酸盐培养基变红不变红色硝酸盐亚硝酸盐硝酸盐氨+氮+试剂（对氨基苯磺酸、-萘胺）Zn变红不变红色（）硝酸盐亚硝酸盐Zn本试验在细菌鉴定中广泛应用。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌等非发酵菌可还原硝酸盐产生氮气。++-2023/3/9351．DNA酶试验在革兰阳性球菌中只有金黄色葡萄球菌产生DNA酶，在肠杆菌科中沙雷氏菌产生此酶。（五）其他生化试验2023/3/936

DNA酶试验原理：

DNA酶

长链DNA寡核苷酸链

（可被酸沉淀：白色）（可溶于酸：透明）2.血浆凝固酶试验作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标，也是葡萄球菌鉴别时常用的一个试验。致病性葡萄球菌具有两种凝固酶:结合凝固酶（结合在菌细胞壁上，相当于纤维蛋白原的受体）游离凝固酶（作用类似凝血酶原，激活后可使血浆凝固）纤维蛋白原纤维蛋白凝固酶血浆液态凝固（－）（＋）（－）（＋）（Coagulasetest）

玻片法试管法2023/3/9383．CAMP试验在链球菌中，只有B群链球菌产生CAMP因子，可促进葡萄球菌产生的beta-溶血素溶解红细胞的能力。金黄色葡萄球菌4.胆汁溶菌试验原理：某些细菌能产生自溶酶使细菌溶解，而胆汁能激活自溶酶加快细菌溶解。应用：肺炎链球菌的鉴定5.卵磷脂酶试验原理：有的细菌产生卵磷脂酶(α-毒素)，在钙离子存在时，此酶可迅速分解卵磷脂，生成浑浊沉淀状的甘油酯和水溶性磷酸胆碱

应用：主要用于厌氧菌鉴定。被检菌划线接种或点种于卵黄琼脂平板上，于35℃培养3--6h2023/3/941（1）O/129抑菌试验用于弧菌科的属间鉴别，弧菌属、邻单胞菌属对O/129敏感，而气单胞菌属耐药。（2）杆菌肽试验用于A群链球菌与非A群链球群的鉴别（抑菌圈直径≥10mm敏感）（3）奥普托欣（Optochin）试验主要用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别（抑菌圈≥14mm为敏感）。6.常见抑菌试验肺炎链球菌对optochin敏感

（抑菌圈≥14mm)A群链球菌对杆菌肽敏感

（抑菌圈≥10mm)2023/3/9437.复合生化试验

44克氏双糖铁培养基②分解葡萄糖+乳糖产酸(乳糖多，产酸多）

斜面和底层均变黄

(KliglerIronAgar,KIA)组成：无糖培养基+1份葡萄糖+10份乳糖+铁盐+酚红

营养底物底物底物指示剂原理：①只分解葡萄糖产酸（葡萄糖少，产酸量少）斜面产生的酸被氧化、挥发、中和，呈红色底层缺氧，不氧化，黄色③产生硫化氢+铁盐FeS黑色沉淀

应用：检测肠杆菌科细菌对乳糖、葡萄糖