高三生物一轮复习DNA的提取与鉴定

答案第=page11页，总=sectionpages11页答案第=page22页，总=sectionpages33页考点四DNA的粗提取与鉴定1.提取DNA的基本思路（DNA的粗提取）及原理思路：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。原理：通过利用不同浓度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以从细胞中提取和提纯DNA；再利用酒精进一步将DNA与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA二苯胺试剂的配制：称取1.5g二苯胺，溶于100ml冰醋酸中，再加入1.5ml浓硫酸，用棕色瓶保存。临用前，在10ml的上述溶液中再加入0.1ml体积分数为0.2%的乙醛溶液。鉴定原理：DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，后者与二苯胺试剂反应生成蓝色物质。2.DNA分子的理化性质（1）DNA的溶解性:DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。蛋白质的盐溶：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。蛋白质的盐析：在盐溶度升高到一定值后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低，结果蛋白质沉淀析出，这种现象叫盐析。(2)DNA不溶于酒精溶液。但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。将DNA与蛋白质进一步分离。【用冷酒精浓缩和沉淀DNA时，所用的95%的酒精必须经过预冷后才能使用】(3)DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。①蛋白酶——水解蛋白质，对DNA没有影响②高温——大多数蛋白质不能忍受60～80℃,而DNA在80℃以上才会变性【蛋白质变性会沉淀，DNA变性只是解链，并不沉淀】③洗涤剂——瓦解细胞膜，但对DNA没有影响【洗涤剂：离子去污剂（可有沐浴露、洗洁精等）,双亲分子，能使细胞膜被乳化，造成细胞膜被破坏，细胞解体。原因：洗涤剂中含有十二烷基硫酸钠和碱。可以使细胞破裂，蛋白质变性，使蛋白质与DNA分离，有利于DNA释放。】植物细胞需要先用洗涤剂处理。动物细胞膜外面没有细胞壁，不需要用洗涤剂破坏。3、实验步骤：（一）实验材料的选取从下列材料中选取2～3种：菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞；在液体培养基中培养的大肠杆菌原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑。但是，选用DNA含量相对较高的组织，成功的可能性更大目前常用材料：新鲜的鸡血（注意要加入柠檬酸钠，防止血液凝固）原因：鸡血细胞中DNA含量丰富，且材料易得。【盛放鸡血细胞液的容器最好是塑料器具，因为DNA容易被玻璃制品吸附，影响最终的DNA提取量。】思考：能否选用牛、羊、猪红细胞血做实验材料？为什么？不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核、细胞器，不含DNA.（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液（1）动物细胞动物细胞的破碎较易，以鸡血为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。讨论1：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗溶液，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。①搅拌的目的：（注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能过快过猛，防止打碎DNA）加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA②过滤后收集滤液：获得含核物质的滤液（获取含DNA的滤液）（注意：此时释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起，应用3——4层纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质）③滤液中可能含有的细胞成分：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质（为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理）（2）植物细胞①植物细胞需要先用一定的洗涤剂溶解细胞膜讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。【本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物，在严格的科学实验中很少使用】②实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等（三）除去滤液中的杂质方案一：含DNA的滤液＋2mol/LNaCl（DNA溶解）→过滤得到滤液→加入蒸馏水，调节NaCl溶液浓度为0.14mol/L（DNA析出）→过滤得到含DNA的粘稠物→2mol/LNaCl溶液中溶解→过滤得到含DNA纯度较高的滤液思考1：加入2mol/L的NaCl溶液，搅拌1min，注意应沿一个方向，目的是？目的是使DNA充分溶解思考2：过滤溶解有DNA的2mol/L的NaCl溶液，获得什么？这一步过滤的目的是？获得含DNA的滤液目的是：除去不溶的杂质思考3：加蒸馏水的目的是？调节NaCl溶液物质的量为接近0．14mol/L，使DNA黏稠物最大限度的析出。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，直至溶液中黏稠物不再增加并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕。同时应注意控制加水量，使NaCl溶液的始终浓度为0.1～0.2mol/L。加水太多、溶液过稀，会使DNA分子又重新溶解。思考4：这一步搅拌的目的是？（轻轻地沿一个方向不停地均与搅拌）稀释NaCl溶液,析出DNA黏稠物思考5：这一步过滤含DNA黏稠物的0．14mol/L的NaCl溶液，获得什么？获得DNA黏稠物（纱布上的DNA黏稠物）思考6：过滤的目的？获得DNA黏稠物。除去溶液中的杂质讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。原理：利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的DNA与蛋白质分开；原理：利用DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，使蛋白质变性，沉淀，与DNA分离（四）DNA的析出与鉴定（1）DNA的析出滤液+同体积、冷却的95%酒精，静置→白色丝状物→玻璃棒沿一个方向搅拌①搅拌的目的(玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌)：卷起DNA丝状物，获取含杂质较少的DNA②冷却的酒精溶液(体积分数95％)作用：一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。（2）DNA的鉴定①向两支试管中分别加入2mol/LNaCl溶液5ml②其中一支试管中加入DNA丝状物，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解③向两支试管中各加入二苯胺试剂4ml④混匀后，置于沸水浴中加热5min⑤待试管冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化观察现象：溶解丝状物的溶液变为蓝色【鉴定时蓝色的深浅与溶液中DNA的含量多少有关】思考1：DNA和RNA在细胞中的分布实验中用的试剂是？甲基绿不能用二苯胺，原因沸水浴会使细胞内成分位置移动思考2：可以单独用甲基绿鉴定某种物质是否是DNA吗？不可以，甲基绿同样会和RNA结合呈绿色！4、DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、2、4、4、6”加蒸馏水2次第一次：加到鸡血细胞中，使鸡血细胞吸水张破(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA第二次：加到含有DNA的物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液，调节NaCl溶液物质的量浓度下降到0．14mol/L，使DNA黏稠物最大限度的析出析出DNA2次第一次：用0.14mol／L的NaCI溶液析出DNA，过滤除去溶液中的杂质第二次：用冷却的95％的酒精，获得含杂质较少的DNA丝状物（利用DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精）用纱布过滤4次过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液：获得含核物质的滤液过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液：得到含DNA的滤液过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液：获取纱布上的DNA粘稠物过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液：得到含DNA的滤液用NaCl溶液4次①加2mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；②用0.14mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；④用2mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA用玻璃棒搅拌6次第一次搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液：加速了鸡血细胞的破裂第二次搅拌含DNA的2mol/LNaCl溶液的滤液：加速DNA溶解第三次搅拌加蒸馏水至0.14mol/L的NaCl溶液：稀释NaCl溶液,析出DNA黏稠物第四次搅拌含DNA（纱布上的粘稠物）的高浓度盐溶液：使DNA黏稠物充分溶解在2mol/LNaCl溶液中第五次搅拌含DNA的体积分数为95%的酒精溶液：卷起DNA丝状物，提取含杂质较少的DNA第六次搅拌含DNA白色丝状物的盐溶液：加速DNA水解第1次快速搅拌,后5次都是缓慢搅拌，防止DNA分子断裂5、注意事项①破碎细胞，释放DNA的过程中，若是血细胞，加水后必须充分搅拌，不应少于5min；若是肝脏细胞或是植物细胞，则应与研磨液混合，必须充分研磨，研磨时间不少于10min②过滤含DNA的滤液时，不能用滤纸代替纱布，否则会因DNA吸附到滤纸上而损失大量DNA。③加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。④在用玻璃棒搅拌时，玻璃棒不能直接插烧杯底部，并且搅拌要轻缓，并沿同一个方向，以便获得较完整的DNA分子⑤二苯胺试剂要现配现用，否则二苯胺会变成浅蓝色，影响鉴定效果。⑥提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。6、实验现象不明显的原因分析①材料中核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏③二苯胺配制时间过长，变成浅蓝色，影响鉴定效果④析出含DNA的黏稠物时，蒸馏水一次快速加入，影响实验结果⑤实验中有多次搅拌，但是其目的及操作方法是不同的，操作时不注意区分，影响实验结果（注意