数字PCR 技术大盘点

2/2数字PCR大盘点数字PCR技术原理数字PCR技术被很多人称为“第三代”PCR技术，不同于qPCR，数字PCR将稀释后的反应体系分散成数万个微小独立反应体系（微液滴），并对微液滴反应体系进行分隔（Partition）的操作，每个反应微液滴包含零、一种或仅仅数种DNA分子，扩增完成后对所有的微液滴进行荧光信号识别并计数，以此计算出阴性和阳性反应的数量，根据相对比例和微液滴的体积，通过泊松分布原理计算靶标分子的浓度，从而实现靶标分子的绝对定量。数字PCR结果判定不依赖标准曲线，并且不受PCR扩增效率影响，具有比qPCR更高的灵敏度、准确度以及重现性，可以实现绝对定量分析。泊松分布原理及公式数字PCR的发展史1988年，CetusCorporation首次发表数字PCR的方法，当时研究人员通过将样品分开，某些反应包含目标分子，而另一些则不包含，证明可以通过PCR检测和扩增单个β-珠蛋白分子。1990年，PeterSimmonds和AJBrown首次使用此概念对分子进行量化。1992年，AlexMorley和PamelaSykes正式建立了该方法作为核酸的定量技术。1999年，BertVogelstein等人在美国科学院院刊PNAS上首次提出了数字PCR（DigitalPCR,dPCR）的概念，并表明该技术可用于研究罕见的癌症突变。2003年，Kinzler和BertVogelstein继续完善dPCR，并创建了一种改进的方法，他们将其称为BEAMing技术，即“珠子，乳状液，扩增和磁性”的首字母缩写。BEAMing技术使用乳状液在单个试管中分隔扩增反应。这一变化能在一次运行中将该PCR扩展到成千上万的反应。再往后，随着纳米制造技术和微流体技术（nanofabricationandmicrofluidics）的发展，数字PCR技术逐渐突破瓶颈，快速发展。数字PCR技术流分类目前，dPCR的基本方法都已经建立，根据反应单元的不同形式，主要可分为微板式、微腔式和和微滴式三大类系统。微液滴制备的方法，目前主流的有四种：1）芯片微孔物理分割法，俗称物理分隔法，代表公司有Fluidgm,Qiagen,Roche，ThermoFisher,；2）液滴分割法,俗称油包水，代表公司有Bio-Rad；3）杂交式芯片液滴法，代表公司有Stilla；4）注射振动制滴法，算是国内首创。PS：芯片式物理分割技术专利（US006143496A）已经过期，目前有不少公司在这个技术的基础上进行开发，例如罗氏。数字PCR通俗分类及特点国外数字PCR盘点（一）BiomarkHD（Fluidigm）2006年，商业数字PCR“鼻祖”，美国Fluidigm公司推出了第一台商业化的基于芯片的商品化数字PCR系统BiomarkHD，Fluidigm的IFC(integratedfluidiccircuits)是一个纳米流体生物芯片，使用物理矩阵的策略，可以用分离的单个DNA模板分子进行数字PCR反应，该芯片包含一个流体管线、NanoFlex™阀门和腔室的网络。BiomarkHD系统integratedfluidiccircuits芯片QX200（伯乐）2011年，美国伯乐（Bio-Rad）公司正式将美国QuantaLife公司收入麾下，将QuantaLife油包水微滴生成技术数字PCR更名为QX100，推向市场。QX100dPCR利用油包水技术，将样品平均分配到20000个微滴油包水中，利用微滴分析仪对微滴进行分析。2013年，日后成为经典的QX200微滴式数字PCR系统问世。QX200整个系统包含4台设备，一台配套的液滴生成仪，一台配套滴液信号读取分析仪，一台通用型的PCR热循环仪，和一台PCR96孔板封膜仪。大致的流程是：液滴生成仪通过油包水的方式，在2分钟生成20,000个油包水微微滴，在普通PCR仪上扩增，最后通过微滴信号读取分析仪读取所有微滴的荧光信号。PS：虽然郎中象觉得操作有点复杂，但并不影响QX200在全球市场上攻城略地。RainDrop（伯乐）2012年RainDance公司推出了RainDrop数字PCR仪，RainDrop数字PCR系统包含3台设备，一台Thunderbolts液滴生成仪、一台通用型PCR热循环仪（PCRthermalcycler）、一台Sense液滴信号读取分析设备。Raindrop数字PCR能够提供更高的检测动态范围，适用于处理更大浓度差异的不同样品，这个设备将其原有的二代测序文库制备平台技术平移到数字PCR技术平台。在空气压力驱动下，Thunderbolts将每个标准反应体系分割成包含100万至1,000万（50微升）个皮升级别微滴的反应乳液。由于Raindrop采用流式细胞仪读取法分析，据说读完百万量级液滴需要近10个小时，而且一次实验需要两张芯片。由于芯片太过复杂，导致RainDrop系统很费钱，卖得也不好。2017年，RainDance公司被Bio-Rad收入囊中。QXONE（伯乐）2020年，Bio-Rad正式发布数字PCR一体机系统——QXONE，该系统无缝集成了微滴生成、热循环反应及微滴读取分析等步骤，配备4个独立的荧光检测通道，可以在单反应孔中实现8重拷贝数变异（CNV）检测、5重突变检测或4重基因表达检测。全自动无人值守的QXONE，一天内可以完成多至5块反应板（480个反应）的数字PCR实验及分析。Continuum（伯乐）Dropwork公司位于科罗拉多州，一家典型的小微公司，数字PCR产品叫Continuum，没有看到上市，产品外观图如下（老外的产品造型总是那么拉风）Continuum系统Dropwork数字PCR系统Continuum的加热方式有点特别，Dropwork公司拿到了亚利桑那州立大学的“连续流空间热循环”专利授权，并把它用在了Continuum上。连续流空间热循环技术原理将加热模块拼接成圆筒状，圆筒不同的扇区设置不同的恒定温度，将细长管以包裹的形式缠绕圆筒，液滴在细长管中，被油相裹挟着一圈圈环绕流经两个扇形温区，完成扩增。该系统属于典型的连续流数字PCR，所以样品是按顺序装载和处理的。连续流动的空间热循环方法使每个液滴和每个扩增循环都有一致的受热温度。Continuum也是一个集成仪器，因为分割30,000个液滴→热循环扩增→结果分析都在同一台仪器中完成。Continuum具有四色检测通道，处理一个检测需要四个多小时。2021年，Bio-Rad将Dropwork公司揽入怀中。今年上半年，伯乐推出新款QX600微滴式数字PCR系统（ddPCR™），设备外观和机理与QX200一致，配置六色（FAM、HEX、Cy5、Cy5.5、ROX和ATTO590）检测通道，单孔中可定量12个靶标，检测试剂和耗材也与QX200完全兼容。参考资料：/s?__biz=MzI5MjUxMTY0OA==&mid=2247536244&idx=1&sn=8b6e8ae95991bd0a7c23c67ced63e723&chksm=ec0244bbdb75cdadb694dcf01f7ae2e0fd5950ba1280fcc7a6ccfed0ea393101835ede68cf85&scene=27上一篇介绍了数字PCR原理和发展史，以及伯乐的数字PCR产品，呈现了伯乐在数字PCR领域的豪横发迹史。IVD业界对于数字PCR的应用前景，充满着不小的争议，很多朋友对“第三代PCR技术”的说法嗤之以鼻，qPCR和数字PCR的代差争议，后面再讲。虽然有争议，但不可否认的是，行业头部企业们，都在纷纷跟进布局。相较于实时荧光定量PCR，数字PCR的优势在于●高灵敏度，可实现单分子级检测数字PCR本质上将一个传统的PCR反应变成了数万个PCR反应，在这数万个反应单元中分别独立检测目的序列，从而大大提高了检测的灵敏度。●高精度，可检测微小差异数字PCR技术能从复杂背景序列中检测低丰度目的序列，在大量野生型基因存在的情况下精准地检测低含量的突变基因。●绝对定量，不依赖标准品和参考曲线数字PCR直接计算目的序列的拷贝数，无需依赖于Ct值和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测。●高重复性，受扩增效率偏差影响小FAM、HEX和Cy5通道浓度平均值和CV值的数据表明，在所述的实验条件下，三种测试浓度之间没有统计学上的差异(p<0.05)。●强耐受抑制物，更适用于多种性复杂样本数字PCR不受PCR抑制物的影响、不依赖标准曲线的优势，使其特别适合于土壤、血液、食品等复杂样本中基因表达的准确定量检测。有优势就有劣势，数字PCR目前普遍设备成本高、通量小、耗材复杂、使用成本高、检测范围较窄。市面上部分dPCR液滴生成、扩增、检测分别在不同仪器中完成，操作繁琐，增加了系统的复杂性和交叉污染风险。国外数字PCR盘点（二）QuantStudio3D（赛默飞世尔）2013年4月，赛默飞世尔（ThermoFisher）以136亿美元收购LifeTechnologies。同年年6月，赛默飞世尔正式推出QuantStudio™3D数字PCR系统。IVD智造，赞1QuantStudio3D数字PCR平台采用的是硅基材料纳升微孔板芯片物理分割技术，其基本的检测流程是：将PCR反应混合物加入到涂布器中，通过涂布器将反应液均匀涂布在有20,000个微孔的芯片上，将芯片放在PCR热循环仪上扩增，最后将芯片放入读取仪中采取拍照的方式读取荧光信号。整个过程在封闭的芯片中进行，样本之间保持完全隔离，可以有效防止样品交叉污染，减少移液过程。同时芯片式设计避免了微滴式系统可面临的管路堵塞问题。但是，操作流程太复杂了。QuantStudioAbsoluteQ（赛默飞世尔）ThermoFisher2021年收购Combinati公司，紧接着推出了QuantStudioAbsoluteQ一体式数字PCR系统。系统集成了液滴制备、PCR扩增、荧光信号收集、数据分析步骤；最多支持5色荧光通道检测；检测全流程1.5小时。赛默飞基因科学，赞111QuantStudioAbsoluteQ系统采用具有专利的微流体阵列式芯片技术，单个样本区在20480个固定纳米级微孔中生成95%以上的有效反应液滴，死体积<5%。每张芯片可以灵活的选择每次检测4个/8个/12个/16个样本，液体生成无需使用液滴油，但芯片通路最后需要用油相密封。基本检测流程是，将PCR反应混合物加入阵列式芯片，放入系统中，在阵列式芯片平铺生成液滴后，利用拍照方式读取荧光信号，全程无需人员值守。Naica™Crystal（Stilla）Stilla成立于2013年，总部位于法国，2016年推出Nacia数字PCR产品，2018年由IlluminaVentures领投完成A轮融资。Stilla数字PCR系统由两台设备组成，产品有Naicacrystal微滴数字PCR系统、NaicaHT高通量数字PCR系统、六通道微滴数字PCR系统等。Naica™Crystal微滴数字PCR系统采用独有的cutting-edge微流体创新型2DSapphire芯片，芯片内预置滴液油，仅需将PCR预混液加入Sapphire或Opal芯片中，后续的微滴生成、扩增和分析，整个过程在都封闭的芯片中进行。基本的检测流程是：将PCR反应混合物加入芯片，将芯片放入Geode微滴生成扩增仪，生成微液滴样本于芯片中，在芯片上完成PCR扩增，然后将扩增后的芯片转移至Prism3微滴阅读分析仪，采取拍照的方式读取荧光信号。Prism3微滴阅读分析仪有3色荧光检测通道。Sapphire芯片上有4个样本位，每个样本能生成约30,000个体积25ul的微液滴；Opal高通量芯片上有16个样本位，每个样本能生成约20,000个体积7ul的微液滴；Naica™Crystal系统可以使用上述两种芯片，使用Sapphire芯片可以检测1~12个样本，使用Opal高通量芯片可以检测1~48个样本。Stilla的Geode微滴生成扩增系统是一个混合系统，结合了基于腔室的dPCR的二维阵列格式和使用液滴分区隔离，采用压力梯度的机制产生液滴；首先，将准备好的微流控芯片放置在平板热循环仪上，并将压力室的盖子封紧。然后，随着分割和PCR程序的启动，压力室内的压力逐渐增加到1bar。这个超压通过压敏帽传递到进气口的PCR反应混合物中，但没有直接传递到用固体鲁尔帽密封的出气口。因此，这种压力不平衡造成了PCR反应混合物从入口端口流向微流控网络。当水性PCR反应混合物通过液滴注射喷嘴时，它自发地分解成单分散的液滴，然后被表面张力推进充满油的微流控室中。随着越来越多的液滴产生，它们自我排列成一个紧凑的六边形二维单层。同时，PCR反应混合物流入充满油的腔室，迫使油流经废物通道并进入密封的出口端口，压缩端口中剩余的空气。当出口端口的压力与腔内施加的超压平衡时，流动停止。六通道微滴数字PCR系统不同的是，微滴阅读分析仪NaicaPrism有6色荧光检测通道。QIAcuity（凯杰）凯杰（QIAGEN）2019年收购美国波士顿专注开发数字PCR技术的公司Formulatrix；2020年推出数字PCR一体机系列产品QIAcuity。IVD智造，赞1QIAcuity系列产品最多支持5色荧光通道检测，单次上机检测24~768个样本，检测全流程约2小时。基本的检测流程是：将PCR反应混合物加入纳米微孔板后，贴上封板膜，用配套滚轮辊压，保证面密封，放入系统中，系统自动进行制液滴、扩增、阅读和分析结果，全流程无