易错PCR的基本原理、发展历程及运用前景简述,分子生物学论文

易错PCR的基本原理、发展历程及运用前景简述,分子生物学论文PCR是一种DNA片段体外复制技术，但常有一定的碱基错配发生，一般错配率为10-6~10-5.碱基错配固然降低了DNA序列复制的保真性，但对获得新DNA序列提供了一种可利用的突破口。于是，便出现了易错PCR技术〔Error-pronePCR,epPCR〕.易错PCR是通过改变PCR条件，提高扩增产物的碱基错配率，进而获得与原来不同的DNA序列或基因。易错PCR作为一种简便、有效地获得DNA序列变异的技术，主要是针对特定的基因，这在遗传和基因改进研究中具有宏大的应用前景，但是当前尚无系统的归纳总结。为此，本文综述了易错PCR的概念、原理、方式方法、研究进展、应用情况以及存在的问题，以期为基因体外诱变工作者提供参考。1易错PCR的概念和基本原理1.1易错PCR的概念易错PCR,意为易错条件下的PCR,即容易使复制出的DNA序列出现错误的PCR技术，又称错配PCR或倾向错误PCR,是指通过利用低保真度TaqDNA聚合酶和改变PCR反响条件，降低DNA复制的保真度，在新DNA链合成经过中增加碱基错配，进而使扩增产物出现较多点突变的一种体外诱导DNA序列变异的方式方法。在20世纪50~80年代，随着DNA体外合成、复制理论和技术的逐步成熟，很多人对DNA体外合成、复制经过中发生碱基代换的众多影响因素进行研究，以提高基因体外合成的精到准确性；同时，还有很多研究者在积极寻求能够诱导基因产生各种可能变异的有效方式方法，来模拟自然界核酸、蛋白质的进化经过。Leung等受以上两个不同研究方向的启示，提出了基因在易错PCR条件下产生变异，能够构建突变体库的观点，并建立了易错PCR技术体系。该体系于1992年经Cadwell和Joyce进一步发展得到了完善，当前广泛应用的易错PCR技术多是参照他们的做法。1.2易错PCR的基本原理1.2.1碱基的异构为错配提供了可能组成DNA的4种碱基都有互变异构体存在，华而不实鸟嘌呤〔G〕、胞嘧啶〔C〕和胸腺嘧啶〔T〕3种含氧碱基有酮式和烯醇式两种互变异构体，腺嘌呤〔A〕和胸腺嘧啶两种含氮碱基有胺式、亚胺式两种互变异构体。G、C和T主要以酮式构造存在，烯醇式构造的比率极低，A和T两种含氮碱基上的氮原子主要以氨基〔NH2〕状态存在，以亚胺基〔NH〕状态存在的比率极低.不同同分异构体之间氢原子位置的不同，及同一位置电子云偏离方向的不同，可使得碱基的配对形式发生改变，这样在复制后的子链上就可能出现错配。例如当胸腺嘧啶以酮式构造存在时，与腺嘌呤配对，以烯醇式构造存在时，与鸟嘌呤配对，这样就出现了A能配上C、T能配上G的不稳定碱基对，进而造成错配.早在1953年，当Watson和Crick提出DNA双螺旋构造之后，就提出了在DNA复制经过中出现错配的原因，可能为碱基异构体的存在造成了碱基的错配。由于这种AC、TG的含量极低，至今没有分离到其结晶体，所以这一结论当前还停留在生物化学的理论阶段。1.2.2DNA聚合酶的保真性能够通过改变反响条件降低所有的DNA聚合酶在催化DNA复制的经过中都会出现碱基的错配，不同的DNA聚合酶出错率不同.在已知的几种耐热DNA聚合酶中，TaqDNA聚合酶的错配率最高.TaqDNA聚合酶是发现的耐热DNA聚合酶中活性最高的一种，具有5-3外切酶活性，不具3-5外切酶活性，因而在合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能，所以比有3-5校对活性的DNA聚合酶发生错配的概率较高.TaqDNA聚合酶的最大特点是在高温下保持酶活性，正是由于这一特点才使得PCR技术得以广泛应用，而TaqDNA聚合酶催化DNA复制时出现较低概率的碱基错配又为人们改变基因提供了可能。不过，正常情况下这一错配率并缺乏以诱变一个基因，还需要对PCR反响条件进行改变，以降低其忠实度。通过改变PCR反响条件能够使TaqDNA聚合酶的错误率得到显着放大。根据PCR不同的目的，对DNA聚合酶种类、性能做了更多研究，为了使DNA复制更严谨，发展出了高保真酶；为了使DNA复制时变异率提高，以便得到突变体库，有人试验了选择那种聚合酶、怎样来降低酶的保真性，等等。DNA聚合酶的保真性能够通太多种方式方法来降低，包括使用4种浓度不同dNTP、添加Mn2+、提高Mg2+浓度等。几种诱变方式方法导致扩增DNA链碱基变异的机理各不一样。MnC12是很多DNA聚合酶的诱变因子，参加Mn2+能够降低聚合酶对模板的特异性，提高错配率;4种dNTPs浓度的不平衡能够提高碱基错误掺入的概率，实现错配;Mg2+具有激活Taq酶的作用，增加Mg2+浓度，使之超过正常用量，能稳定非互补的碱基对;提高TaqDNA聚合酶用量、增加每个循环延伸时间，能够增加错配终端延伸的概率；降低起始模板浓度，会使后面PCR循环的变异模板比例增加。2易错PCR技术的发展历程2.1易错PCR基本技术体系的建立与完善易错PCR技术是采用多种方式方法提高DNA聚合酶的碱基错配率，并稳定非互补碱基对。改变PCR反响条件的方式方法主要有4种，一是使用低保真度Taq酶、并加大Taq酶用量；二是调整反响体系中4种dNTP的浓度，使之非1∶1∶1∶1的平衡浓度关系；三是在反响体系中参加一定量的Mn2+;四是增加反响体系中的Mg2+浓度。除此之外，降低起始模板浓度、增加每个循环的延伸时间、提高反响体系pH值、增加循环次数等也都能够明显提高诱变率。几种方式方法可单独使用，但更多的时候是综合使用，以求最简单、快速的得到更多的突变子。在Leung等提出的易错PCR体系中，易错PCR的变异带有强烈的倾向性，即ATGC的变异率明显高于GCAT的变异率。在Cadwell和Joyce修正的体系中ATGC与GCAT变异比率接近，这样，基因的诱变文库会有更好的多样性，并且不会造成不同碱基含量的显着变化。当前常用的标准易错PCR方式方法是参考Cadwell等的方案构成的，即：100L反响体系，含7mmolL-1MgCl2,0.5mmolL-1MnCl2,50mmolL-1KCl,10molL-1Tris-Cl,pH8.3〔25℃〕,1mmolL-1dTTP和dCTP,0.2mmolL-1dATP和dGTP,5U的TaqDNA聚合酶；退火温度的基本设计原则是宜低不宜高；反响不进行热启动和末端延伸。易错PCR诱变出现的最多变异类型是点突变，删除引起的移框突变也偶有出现。常规的PCR100L反应体系含1.5mmolL-1MgCl2、2.5U的TaqDNA聚合酶；不含MnCl2;4种dNTP全部为0.2mmolL-1.即在易错PCR诱变体系中，Mg2+浓度提高4.7倍，TaqDNA聚合酶提高2倍，添加Mn2+,提高5倍的一种或两种dNTP浓度。按以上标准易错PCR体系进行诱变，可构建无序列倾向性的基因随机点突变库，每个核苷酸的突变率约为6.610-3.Riedel的研究结果显示，易错PCR要根据情况选择最佳反响条件。一般增加dATP和dTTP浓度时，宜选择含有Co2+的Buffer;而增加dCTP和dGTP浓度时，宜选择含有Mn2+的Buffer.PCR反响缓冲液中的K+有利于扩增大于500bp长度的DNA片段.陈晓穗等通过对错配PCR致突变条件研究以为，增加dTTP和dCTP浓度的致突变效果优于增加dATP和dGTP的效果；使用5mmolL-1MgCl2、0.5mmolL-1MnCl2、dTTP和dCTP浓度提高到1mmolL-1的条件下，经2轮PCR〔共60个循环〕碱基错配率可达2.4%.其突变类型有明显偏向性，以A/T的突变为主，转换多于颠换。由Cadwell和Joyce完善的易错PCR技术是通过增加DNA聚合酶的错误率来诱导基因变异，这种方式方法得到的诱变率在0.6%~2.0%/bp/PCR之间，当前这种诱变方式方法已经很成熟，很多大型生物试剂公司都有了这种基因体外诱变方式方法的试剂盒。利用试剂盒诱变固然简单，但类型单一，因而在实际操作中，经常根据不同的实验目的对易错PCR进行修改、补充和完善。2.2连续易错PCR在通常情况下，经一轮的易错PCR、定向挑选，很难获得令人满意的结果，由此发展出了连续易错PCR〔Sequentialerror-pronePCR〕,该方式方法是将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复进行随机诱变，使得每一次获得的少量有益突变累积而产生重要的有益突变。连续两轮PCR,或连续多轮易错PCR,突变率可增至一轮易错PCR的3倍.诱变技术的基本要求是创造尽可能多的突变体，但碱基突变率并非越高越好，由于有益突变通常要比有害突变的变异率低很多，一个突变分子中所含的有益突变很有可能会被同时存在的有害突变所抵消或淹没。因而，连续易错PCR要根据基因详细情况设计每一轮PCR的诱变率，建立突变体库，通过高通量挑选，获得有益突变，然后再以其为模板，进行第二轮易错PCR,不断富集有益基因。2.3与DNA改组、模板交织延伸等的联合应用易错PCR技术在体外分子进化的研究中，能够单独使用。随着DNA改组〔DNAshuffling〕和模板交织延伸〔StEP〕等技术方式方法的出现，易错PCR还能够和这些方式方法联合使用，实现变异圃广、变异率高、有益基因出现频率高、挑选变异工作量小的最终目的。DNA改组是指将一组相关DNA序列切割成随机片段后通过PCR进行重新聚合，进而产生突变体。模板交织延伸是一种简化的DNA改组技术，是将模板混合后进行短暂的复性和延伸反响，这样在每个循环中，延伸的片段在复性时会与不同的模板配对，最终合成全长DNA序列。它省去了DNA改组中的酶切程序。DNA改组技术相当于一组相关基因不同序列间的重新排列组合，因而诱变的有益突变率相对较高。易错PCR多用于高频率诱变单个基因，与DNA改组技术联合应用能够集二者的优点，这样不仅能够对单一基因进行易错PCR随机诱变，创造新的基因，还能够将易错PCR获得的有益基因改组，进行序列间的重新编排，进而获得不同种、属基因家族里基因序列变异圃更广、功能更强的基因。一般做法是先用易错PCR引入点突变，构建起始基因文库，挑选出所有良性克隆，再以此作为亲本基因进行DNA改组，使得有益突变迅速积累，基因功能明显提高。而且，这样所建的突变体库小，定向进化效果显着。可以以进行多轮改组，得到更好的结果.因而，易错PCR与DNA改组联合应用逐步成为基因诱变的主要方式方法之一。An等将易错PCR与模板交织延伸相结合，并使之在同一PCR管内进行，简化了操作程序。详细操作经过为：以15个下面循环的易错PCR引入随机变异，PCR诱变产物经乙醇沉淀纯化后，再作为模板和引物，直接进行交织延伸程序进行DNA重组。该方式方法以腺苷甲硫氨酸〔AdoMet〕合成酶基因sam1的诱变为例，建库证实有效，并得到了在体内表达量增加56%的突变子。2.4易错PCR诱变方式方法的补充与完善易错PCR为以PCR为基础的诱变开拓了一条新路，不少学者在沿着这条路寻找新的或愈加完善、愈加简便的诱变技术，如醇介导的易错PCR、易错PCR与交织延伸联合简化诱变方式方法，以及碱基类似物与易错PCR混合使用方式方法等。Claveau研究了醇介导的易错PCR.即在PCR反响体系中参加异丙醇、丙醇或丁醇，根据酶的耐热性和醇的疏水性不同，醇的临界浓度也不同。醇的临界浓度一般随着聚合酶抗热性增加而提高，随醇本身的疏水性提高而降低。研究显示醇的疏水性是影响聚合酶构象的重要因素。当丙醇在体系中的体积比为7.0%到8.0%时诱变率能够到达9.810-3/bp/PCR.这一条件下优先得到碱基G和C的改变，而与此相反，标准易错PCR优先改变碱基A和T.丙醇与MnCl2作用方式不同，丙醇对聚合酶保真性降低的作用是对聚合酶稳定性精细调节的结果。以上的易错PCR研究全部采用改变PCR反响条件，来提高DNA聚合酶错误率的方式方法进行，也有人尝试通过修饰DNA聚合酶来提高常规PCR错配率的研究。Benjamin和Connolly于2004年报道了一个PfuDNA聚合酶的变种在易错PCR反响中表现出极好的性能。PfuDNA聚合酶有两个螺旋构成了聚合酶的指状子域，这一区域负责将碱基与模板链正确地互补配对。当两个螺旋之间的关键氨基酸发生变异，与缺失3-5核酸外切酶活性同时发生时，一个高保真野生型聚合酶就变为了一个低保真聚合酶。这个PfuDNA聚合酶变种能够在标准PCR反响条件下用于诱变基因，并得到高频率、几乎没有任何倾向的变异.这些都是对易错PCR研究的新探寻求索和有益补充。3易错PCR技术的应用及发展前景易错PCR从概念提出、体系完善至今已被广泛应用于生物工程的各个领域。3.1易错PCR技术为特种工业酶的改造提供了有效的工具工业酶的催化反响通常处于高温、有机溶剂、氧化剂、极端酸碱等存在的环境。在自然界进行选择，根本无法挑选到能在上述恶劣条件下完成催化反响的酶。运用易错PCR技术，在人工模拟环境下进行选择，已经成功地得到了各种特种功能的工业酶，可知足工业生产的特殊需要。例如，Zhao等利用连续易错PCR获得了枯草杆菌蛋白酶基因的随机点突变，并用交织延伸方式方法重组DNA,连续提高培养温度对突变体进行挑选，最终获得一株突变体E5-3H5,不仅将酶的最适温度提高了17℃,还使酶在65℃的半衰期增加了200倍。淀粉蔗糖酶是一种催化蔗糖合成直链淀粉的酶，Potocki-Veronese等利用易错PCR和DNA改组技术对其进行突变，得到催化蔗糖活性提高60%的突变体Asn387Asp.易错PCR是蛋白质分子体外定向进化研究最早采用的一种构建基因文库的方式方法，尤其是在酶分子诱变上研究应用最多。3.2在农业生物技术中的应用中国科学院遗传所朱祯实验室采用易错PCR方式方法获得了水稻抗草甘膦突变基因epsp102,突变体对草甘膦和磷酸烯醇式丙酮酸的亲和力分别到达70倍和4.6倍.苏军等将epsp突变基因导入籼稻明恢86,对T3材料进行抗性检测，显示种子萌发时对草甘膦的抗性提高15倍，三叶期对草甘膦的抗性提高3~4倍。在植物的遗传、育种研究中，最缺乏的已经不再是转基因和常规杂交的手段，而是缺乏优异基因。有了专一性优异基因，农业中的高产、抗逆、抗病虫、抗除草剂等新品种、新材料就会快速脱颖而出。易错PCR为我们提供了一种实验室快速获得优质基因的手段。3.3在医药研究中的应用易错PCR技术已成为生物制药研究的有效工具。例如，粘质沙雷氏菌是多种病症的致病菌。刘治江等以重组E.coliBL21〔DE3〕pLysS/pET22b-ChiC为亲本，采用易错PCR对粘质沙雷氏菌几丁质酶C基因〔ChiC〕进行定向进化，经过两轮易错PCR,建立突变体文库，通过挑选获得一个酶活较高的突变酶〔Mut-ChiC〕,其催化活性为亲本重组酶的1.9倍，比活力为出发菌酶活的3.3倍，最适温度由40℃提高到60℃.对进化酶基因测序发现，该基因所编码蛋白有4处氨基酸被取代，均为有义突变。除此之外，易错PCR技术在基础理论研究、生物制药、基因治疗、疫苗研制、石油化工等研究领域也具有广阔的应用前景。4应用特点以及存在问题易错PCR能够随机诱变任何一个克隆基因，建立突变体库，进而扫描到理想性状的表示出序列。诱变中应注意选择最接近人们需要的基因作为起点，若用于理论研究，应控制较低的突变率，使突变多为单一氨基酸取代，这样才能将基因功能变化与突变表型逐一对应起来。第二个需要注意的问题是控制DNA的适宜突变频率。假如DNA的突变频率太高，产生的大多数蛋白将失去活性，假如突变频率太低，突变位点过少，野生型的背景太高，样品的多样性则较少，不利于后续的挑选和鉴定工作。对于每一DNA序列来讲，理想的碱基置换率和易错PCR的最佳条件依靠于随机突变的目的DNA片段的长度。一般每代每序列有2~3个碱基置换或一个氨基酸替代较为适宜.易错PCR方式方法固然已广泛应用，但还是存在一些问题，首要问题是碱基的变异具有倾向性.即在四种碱基比例不平衡的情况下，ATGC的变异比率通常高于GCAT的变异比率，这样就会影响变异的多样性，所以在用此方式方法诱变基因时，一定要注意选择诱变条件。二是易错PCR产量和变异水平偏低。较低的模板浓度以及引物与模板结合严格性的降低，使得目的片段的产量偏低由于碱基变异偏好、转换高于颠换,造成变异圃较窄，筛库得到有益基因的概率降低。三是对模板的要求较高，最好是只含目的基因的DNA片段。PCR在易错条件下进行时，容易造成引物与模板的错误结合，构成大量与目的片段不同长度的非特异扩增产物，模板越长，这种非特异扩增的概率会越大。另外，应用易错PCR时一般都要针对详细基因进行诱变条件的优化，需要优化的条件有多个，包括Mn2+浓度、Mg2+浓度、4种dNTP浓度、TaqDNA聚合酶浓度、模板浓度、延伸时间、循环次数等，这些条件综合起来优化还比拟费力。针对以上问题，可能的解决途径有下面几个：一是从TaqDNA聚合酶的基本特性入手，寻找新的影响酶功能、同时又不带来碱基变异偏好的因素，开发更多的易错PCR方式方法，用于不同目的的诱变，或寻求更佳的诱变方式方法。TaqDNA聚合酶的基本性质中，Mg2+依靠性和几种变性抑制剂对于酶的错误率有很大影响，能够做为研究的目的。在这里研究方面，Claveau等做了成功的尝试，通过醇的疏水性影响Taq酶的构象，提高了碱基错配率。但醇介导的易错PCR出现了GCAT的变异偏好，仍不理想。二是易错PCR多种诱变条件的简化。根据经历体验，多种诱变条件对碱基错配率的奉献不同，对于奉献大的因素，有2~3个条件即可得到2%左右的碱基错配率，这样就大大简化了诱变前期的条件优化工作。随着研究的不断深切进入，易错PCR技术会日臻完善，并更多地应用到生命科学的各个领域，创造更丰富的资源、更多的优异基因。以下为参考文献：[1]LeungDW,ChenE,GoeddelDV.AmethodforrandommutagenesisofadefinedDNAsegmentusingamodifiedpolymerasechainreaction[J].Technique,1989,1:11-15[2]CadwellC,JoyceGF.RandomizationofgenesbyPCRmutagenesis[J].PCRMethodsandApplications.1992,2:28-33[3]沈同，王镜岩。生物化学〔第二版上册〕[M].北京：