分子生物学讲座

分子生物学讲座第1页/共51页个体提示器官、组织细胞动物细胞植物细胞第2页/共51页细胞核结构第3页/共51页第一章核酸的结构与功能

1868年，瑞士的内科医生FriedrichMiescher从外科医院包扎伤口的绷带上的脓细胞核中提取到一种富含磷元素的酸性化合物，将其称为核质(nuclein)；1872年他又从鲑鱼精子中分离出类似的物质，随后有人在多种组织细胞中也发现了这类物质的存在。因为这类物质都是从细胞核中提取出来的，而且都具有酸性，因此称为核酸(nucleicacid)。第4页/共51页肺炎双球菌转化实验第5页/共51页核酸是生物体内的高分子化合物，包括DNA和RNA两大类。一、元素组成组成核酸的元素有C、H、O、N、P等，与蛋白质比较，其组成上有两个特点：一是核酸一般不含元素S，二是核酸中P元素的含量较多并且恒定，约占9～10%。因此，核酸定量测定的经典方法，是以测定P含量来代表核酸量。二、化学组成与基本单位核酸经水解可得到很多核苷酸，因此核苷酸是核酸的基本单位。核酸就是由很多单核苷酸聚合形成的多聚核苷酸。核苷酸可被水解产生核苷和磷酸，核苷还可再进一步水解，产生戊糖和含氮碱基。第一节核酸的化学组成第6页/共51页核苷酸中的碱基均为含氮杂环化合物，它们分别属于嘌呤衍生物和嘧啶衍生物。核苷酸中的嘌呤碱(purine)主要是鸟嘌呤(guanine,G)和腺嘌呤(adenine,A)，嘧啶碱(pyrimidine)主要是胞嘧啶(cytosine,C)、尿嘧啶(uracil,U)和胸腺嘧啶(thymine,T)。DNA和RNA都含有鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)；胸腺嘧啶(T)一般而言只存在于DNA中，不存在于RNA中；而尿嘧啶(U)只存在于RNA中，不存在于DNA中。第7页/共51页第8页/共51页

嘌呤和嘧啶环中含有共轭双键，对260nm左右波长的紫外光有较强的吸收。碱基的这一特性常被用来对碱基、核苷、核苷酸和核酸进行定性和定量分析。核酸中的戊糖有核糖(ribose)和脱氧核糖(deoxyribose)两种，区别在于2`的C原子上。

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戊糖与嘧啶或嘌呤碱以糖苷键连接就称为核苷，通常是戊糖的C1′与嘧啶碱的N1或嘌呤碱的N9相连接。

核苷中戊糖的羟基与磷酸以磷酸酯键连接而成为核苷酸。核苷酸大多数是核糖或脱氧核糖的C5′上羟基被磷酸酯化，形成5′核苷酸。核苷酸在5′进一步磷酸化即生成二磷酸核苷和三磷酸核苷。以核糖腺苷酸为例，除AMP外，还有二磷酸腺苷(ADP，adenosine5′－diphosphate)和三磷酸腺苷(ATP，adenosine5′-triphosphate)两种形式第11页/共51页第12页/共51页第13页/共51页第二节DNA的一级结构

概念是指DNA分子中核苷酸的排列顺序。换句话说，即四种核苷酸(dAMP、dCMP、dGMP、dTMP)按照一定的排列顺序，通过磷酸二酯键连接形成的多核苷酸链。由于核苷酸之间的差异仅仅是碱基的不同，故又可称为碱基顺序。DNA顺序（或序列）是这一概念的简称。第14页/共51页核苷酸之间的连接方式是：一个核苷酸的5′位磷酸与下一位核苷酸的3′-OH形成磷酸二酯键，构成不分支的线性大分子，其中磷酸基和戊糖基构成DNA链的骨架，可变部分是碱基排列顺序。“寡核苷酸”的概念第15页/共51页第16页/共51页5`pTpCpAOH3`5`TCA3`TCA表示方法不断简化第17页/共51页第三节DNA的二级结构

(一)DNA的二级结构：双螺旋结构模型

1868年，Miescher已经从脓细胞提取到核酸与蛋白质的复合物，当时称为核质(nuclein)。20世纪20年代，Levene研究了核酸的化学结构并提出四核苷酸假说。40年代末，Avery,Hershey和Chase的实验严密地证实了DNA就是遗传物质。50年代初，Chargaff应用紫外分光光度法结合纸层析等简单技术，对多种生物DNA作碱基定量分析，发现DNA碱基组成有如下规律。第18页/共51页(1)同一生物的不同组织的DNA碱基组成相同；(2)一种生物DNA碱基组成不随生物体的年龄、营养状态或者环境变化而改变(3)几乎所有的DNA，其腺嘌呤摩尔含量与胸腺嘧啶摩尔含量相同A=T；鸟嘌呤摩尔含量与胞嘧啶摩尔含量相同G=C(4)不同生物来源的DNA碱基组成不同，表现在A＋T/G＋C比值的不同第19页/共51页1953年，Watson和Crick以立体化学原理为准则，对Wilkins和Franklin的DNAX射线衍射分析结果加以研究，提出了DNA结构的双螺旋模式。主要内容包括以下四点。第20页/共51页DNAX射线衍射结果第21页/共51页(1)两股DNA链围绕一假想的共同轴心形成一右手螺旋结构，双螺旋的螺距为3.4nm，直径为2.0nm。(2)链的骨架由亲水的脱氧核糖基团和磷酸基团构成，位于双螺旋的外侧。(3)碱基位于双螺旋的内侧，嘌呤和嘧啶碱基彼此密切相近。一股链中的嘌呤与另一股链中嘧啶之间以氢链相连，称为碱基互补配对或碱基配对；碱基对层间距离为0.34nm。碱基互补配对总是腺嘌呤与胸腺嘧啶之间(A=T)，形成两个氢键；或者鸟嘌呤与胞嘧啶之间(G=C)，形成三个氢键。

(4)DNA双螺旋中的两股链走向是反向平行的，一股链是5′→3′走向，另一股链是3′→5′走向。两股链之间在空间上形成一条大沟和一条小沟，这是蛋白质识别DNA的碱基序列，与其发生相互作用的基础。

第22页/共51页氢键第23页/共51页影响双螺旋结构的因素有四个1、氢键。例如，DNA溶液中加入了尿素和甲酰胺后，由于它们很容易和碱基之间形成氢键，从而减少碱基之间的形成氢键的机会。2、碱基堆积力，指同一条链中相邻碱基之间非特异性的作用力，又叫疏水力，爱德华力。3、带负电荷的磷酸集团的静电排斥力。当磷酸集团的负电荷被带正电的离子中和后（加入盐类），磷酸集团之间的排斥力被屏蔽。结构就稳定，否则，二个链会因为排斥而分开（在纯净的蒸馏水中DNA会变性）。4、碱基分子内能。某些因素如加热等使得分子内能改变时，结构会遭到破坏。第24页/共51页Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构属于B型双螺旋，它是以在生理盐溶液中抽出的DNA纤维在92%相对湿度下进行X－射线衍射图谱为依据进行推测的，这是DNA分子在水性环境和生理条件下最稳定的结构。

DNA结构的多态性表现在除了稳定的B型结构外，还有A型、C型、D型、E型等不同的形式。总之，DNA的双螺旋结构永远处于动态平衡中，DNA分子构象的变化与糖基和碱基之间空间相对位置有关。(二)DNA结构的多态性第25页/共51页1979年，Wang和Rich等人在研究人工合成的CGCGCG单晶的X-射线衍射图谱时出人意料地发现这种六聚体的构象与上面讲到的完全不同。它是左手双螺旋，与右手螺旋的不同是螺距延长(4.5nm左右)，直径变窄(1.8nm)，每个螺旋含12个碱基对，分子长链中磷原子不是平滑延伸而是锯齿形排列，有如“之”字形一样，因此叫它Z构象(英文字Zigzag的第一个字母)。第26页/共51页

人们相信，并用实验证明了细胞DNA分子中确实存在有Z－DNA区。而且，细胞内有一些因素可以促使B－DNA转变为Z－DNA。有研究认为这种构像和甲基化现象有关系。第27页/共51页随着科学的发展，人们认识DNA的水平不断提高。多年来，DNA结构的研究手段主要是X射线衍射技术，其结果是通过间接观测多个DNA分子有关结构参数的平均值而获得的。同时，这项技术的样品分析条件使被测DNA分子与天然状态相差甚远。因此，在反映DNA结构真实性方面这种方法存在着缺陷。

1989年，应用扫描隧道显微镜(scanningtummelingmicroscopy,STM)研究DNA结构克服了上述技术的缺陷。这种先进的显微技术，不仅可将被测物放大500万倍，且能直接观测接近天然条件下单个DNA分子的结构细节。中国科学院的白春礼等就是利用这种技术发现了DNA的三辩式结构。

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在DNA的一级结构中，四种碱基远非均匀分布，尽管双螺旋的构型大体相同，但沿着DNA链各处的物理结构不完全相同，各处双螺旋的稳定性也就显示出差别，充分体现了DNA一级结构决定高级结构的原理。其不均一性主要有1.反向重复序列(invertedrepeats)

又称回文序列(palindrome)，通常是作为一种特别信号，如限制性内切酶及调节蛋白的识别位点，转录终止信号等2.富含A/T的序列在很多有重要调节功能的DNA区段都富含AT，特别是在复制起点和启动子的序列中，其对于复制和起始十分重要。因为A－T对只有二条氢键，易于解开，利于起始复合物的形成。(三)DNA结构的不均一性(heterogeneity)第29页/共51页3.嘌呤和嘧啶的排列顺序对双螺旋结构稳定性的影响。前者的稳定性远大于后者。氢键数目是相同的，差别在于相邻碱基之间堆集力不同。即从嘌呤到嘧啶的方向的碱基堆集作用显著大于同样组成的嘧啶到嘌呤方向的碱基堆集作用。5`GC3`5`CG3`3`CG5`3`GC5`

和第30页/共51页1.DNA变性(denaturation)

指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性。(四)DNA的变性、复性与分子杂交

第31页/共51页溶液粘度降低。超螺旋结构解旋，氢键断裂。溶液旋光性发生改变增色效应，指变性后DNA溶液对紫外吸收作用增强的效应。DNA分子中碱基间电子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波长紫外光的特性。在DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。如浓度均为50ug/ml时，双螺旋的A260=1.00；完全变性的A260=1.37；单核苷酸等比例混合物的A260=1.60变性DNA常发生一些理化及生物学性质的改变第32页/共51页

对双链DNA进行加热变性，当温度升高到一定高度时，DNA溶液在260nm处的吸光度突然明显上升至最高值，随后即使温度继续升高，吸光度也不再明显变化。若以温度对DNA溶液的紫外吸光率作图，得到的典型DNA变性曲线呈S型。可见DNA变性是在一个很窄的温度范围内发生的。通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为核酸的解链温度，由于这一现象和结晶的融解相类似，又称融（熔）解温度(Tm,meltingtemperature)解链温度（Tm值）的概念第33页/共51页第34页/共51页

在Tm时，核酸分子内50%的双螺旋结构被破坏。特定核酸分子的Tm值与其G＋C所占总碱基数的百分比成正相关，两者的关系可表示为：Tm=69.3＋0.41(%G+C)

此关系式成立的条件是：GC含量在30%-70%之间，溶液为0.15M的NaCl+0.015M的柠檬酸钠。

一定条件下(相对较短的核酸分子)，Tm值大小还与核酸分子的长度有关，核酸分子越长，Tm值越大；另外，溶液的离子强度较低时，Tm值较低，融点范围也较宽，反之亦然，因此DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中。第35页/共51页第36页/共51页

指变性DNA在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为退火(annealing)。复性的条件1、有足够的盐浓度来消除磷酸集团的静电排斥力。2、足够高的温度来破坏氢键，但又不能太高。复性的机制随机碰撞，成核作用，拉链作用。2.DNA复性(renaturation)第37页/共51页

（1）温度和时间一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢。复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温(如4℃以下)，复性几乎是不可能的(实验室经常用此方法使DNA保持单链或者叫变性状态)。（2）DNA浓度浓度高，碰撞的机会多，复性快。（3）DNA碱基顺序的复杂性顺序简单，复性容易；反之亦反。注意：复性后大部分不是原配链。影响DNA复性的因素第38页/共51页3、应用

分子杂交

PCR技术第39页/共51页分子杂交示意图第40页/共51页PCR反应示意图第41页/共51页第四节DNA的三级结构

(一)DNA超螺旋

双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形成其三级结构，超螺旋是DNA三级结构的主要形式。自从1965年Vinograd等人发现多瘤病毒的环形DNA的超螺旋以来，现已知道绝大多数原核生物都是共价封闭环(covalentlyclosedcircle,CCC)分子，这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋结构(superhelix或supercoil)。第42页/共51页原核生物的超螺旋结构（PM2病毒）。有正超螺旋和负超螺旋之分。真核生物中，DNA与组蛋白八聚体形成核小体结构时，存在着负超螺旋。第43页/共51页(二)染色质和核小体1、染色质(chromatin)

真核生物的染色体(chromasome)在细胞生活周期的大部分时间里都是以染色质的形式存在的。染色质是一种纤维状结构，叫做染色质丝，它是由最基本的单位核小体(nucleosome)成串排列而成的。DNA是染色体的主要成分，约占染色体全部成分的30-40%，另