分子生物学第17讲

分子生物学第17讲第1页/共61页二、CAP对启动子的正调控1，cAMP在分解代谢产物抑制中的作用2，CAP的作用（1）CAP的结构特征（2）CAP结合的DNA位点（3）CAP的激活第2页/共61页（4）CAP对转录的激活作用A，CAP激活转录的途径B，CAP与DNA和RNA聚合酶的作用C，CAP对RNA聚合酶的作用取决于两者的相对位置：第3页/共61页第四节操纵元的其他调控形式一、具有双启动子的半乳糖操纵元（一）半乳糖代谢1，半乳糖代谢相关的酶（1）半乳糖激酶（2）半乳糖转移酶（3）半乳糖表异构酶第4页/共61页2，代谢步骤（二）gal操纵元1，gal操纵元组成（1）结构基因（galK，galT，galE）（2）调节基因（galR）（3）P/O位点第5页/共61页2，gal操纵元的启动子（图8－9）（1）galP1（2）galP2第6页/共61页（三）cAMP-CAP对galP1和galP2的控制1，gal启动子的cAMP-CAP结合位点（1）位置：-76~-47（2）序列特点（图8－10）第7页/共61页2，cAMP-CAP对S1转录的激活及对S2转录的阻遏对galP1对galP2第8页/共61页（四）Gal阻遏蛋白的作用机制1，gal阻遏蛋白的作用位点2，gal阻遏蛋白可能的作用机制（1）gal阻遏蛋白与galOE结合，可能通过以下途径发挥作用第9页/共61页（２）gal阻遏蛋白与galOI结合可能导致两个操作子之间的DNA形成环状结构，两个阻遏蛋白通过相互作用而强化了阻遏效应第10页/共61页（五）gal操纵元双启动子的意义1，半乳糖的双重作用（1）作为细菌的碳源（2）UDPGal是细菌细胞壁的重要前体2，双启动子的作用（1）galP1保证细菌可以利用半乳糖作为碳源（2）galP2保证有葡萄糖存在时，细菌可以合成UDPGal第11页/共61页二、阿拉伯糖操纵元：具有双重功能（正调控和负调控）的调节蛋白(一)阿拉伯糖代谢酶基因的操纵元1，阿拉伯糖调控元（1）三个参与阿拉伯糖代谢的酶的基因的操纵元（2）调控元：由一个调节基因控制几个操纵元的系统第12页/共61页2，araBAD操纵元的组成（1）结构基因（2）操纵元结构（图8-11）（二）araBAD操纵元的调控第13页/共61页1，araC基因产物及其结合位点（1）araC基因对araBAD正调控的遗传学证据（2）AraC蛋白的2种形式（3）AraC结合位点第14页/共61页2，对araBAD操纵元起调控作用的因素（1）Crep

对araBAD及araC的作用A，Crep

与araO1结合B，Crep

与araO2结合（2）Cind对araBAD及araC的作用（3）cAMP-CAP是araBAD和araC表达的正调控因子第15页/共61页3，araBAD操纵元的调控（图8－12）（1）无AraC及cAMP-CAP时，araC转录，但很快会被Crep所阻遏（自身调控）（2）有AraC，无cAMP-CAP时，araBAD和araC均不转录（3）有AraC，阿拉伯糖及cAMP-CAP时，araBAD转录（4）Cind

和cAMP-CAP促进araBAD转录的机制促进RNA聚合酶与araBAD的结合并形成开放性启动子复合物第16页/共61页

三、色氨酸操纵元：可阻遏系统（一）

trp操纵元的结构1，结构基因及其编码的酶2，前导序列3，终止子4，调节基因第17页/共61页（二）Trp操纵元的阻遏调控1，Trp的作用Trp有两方面的作用（1）对已有的酶起反馈抑制（feedbackinhibition）（2）作为trp无活性的阻遏蛋白的辅阻遏物第18页/共61页2，TrpR的作用（1）TrpR的活性形式（2）TrpR的作用机制第19页/共61页第五节基因表达的时序调控时序调控：按照一定的时间顺序实现的基因表达调控机制第20页/共61页基因转录时序调控的必要性：使生物能够有效地利用资源，避免某些基因不适当表达可能带来的危害基因转录时序调控的方式：大多数是通过一种或几种蛋白质因子与RNA聚合酶相互作用而实现的第21页/共61页一、噬菌体基因表达特点概述（一）噬菌体基因组构成1，基因构成（1）转录和翻译所必需的基因感染初期噬菌体均利用宿主的转录系统，随后噬菌体合成一些自身编码的蛋白质，对宿主的RNA聚合酶进行替代或修饰，其结果是使转录系统优先转录噬菌体的mRNA。噬菌体倾向于使用宿主的蛋白质合成系统第22页/共61页（2）DNA复制相关基因噬菌体常利用宿主的复制体系成分，这些基因与复制的起始有关，有的噬菌体基因组编码DNA聚合酶和某些复制相关的蛋白质第23页/共61页（3）噬菌体颗粒结构和装配相关基因通常，噬菌体的头部和尾部需要许多种蛋白质，因此，噬菌体晚期功能区构成了基因组的最大部分第24页/共61页2，遗传图谱的特点噬菌体的遗传图谱的组织常常反映其基因表达的顺序。在噬菌体中，操纵元的作用被发挥到极致。编码功能相关的蛋白质的基因聚集成簇，使得少数几个调节蛋白质就可以控制整个基因组的表达，实现最经济的调控第25页/共61页（二）溶菌周期的分期1，早期感染（earlyinfection）：指噬菌体DNA进入宿主到噬菌体DNA复制开始的一段时间。这一时期主要是产生DNA复制所需的酶第26页/共61页2，晚期感染（lateinfection）：指噬菌体DNA复制开始到细菌裂解，释放后代噬菌体颗粒的一段时间。在这段时期，噬菌体完成DNA的复制、噬菌体颗粒的蛋白组分的合成。除此还需要合成组装蛋白和溶菌蛋白，帮助组装噬菌体颗粒和最终释放子代噬菌体第27页/共61页（三）噬菌体基因表达的级联式控制噬菌体的基因表达是在调节蛋白质的级联式控制进行的。前一个阶段的基因表达是后一个阶段基因表达所必需的。在每个阶段有一个或多个基因产物作为后续阶段的调节物。调节蛋白质可以是新的RNA聚合酶、新的σ亚基和抗终止因子等第28页/共61页1，第一阶段的基因表达噬菌体感染第一个阶段的基因表达要依赖宿主的转录体系。这些基因常被成为早期基因（earlygenes），在λ噬菌体中称为极早期基因（immediateearlygenes）。这些基因的启动子和宿主基因的启动子是没有区别的。通常这个阶段只表达少数几个基因，其中总有一个基因编码下一批基因表达所必需的调节蛋白质第29页/共61页2，第二阶段的基因表达这个阶段表达的基因被称为迟早期基因或中期基因。这批基因通常在早期基因编码的调节蛋白质一出现就开始表达。此时宿主的基因表达常常被抑制第30页/共61页3，晚期基因表达当噬菌体DNA复制开始，晚期基因开始表达。其转录是在第二阶段合成的调节蛋白质的控制下进行的第31页/共61页二、枯草杆菌中σ亚基的更迭（一）枯草杆菌噬菌体SPO1早、中晚期基因表达的转换1，SPO1生活史（1）早期：侵染~侵染后4~5min（2）中期：侵染4~5min至8~12min（3）晚期：侵染8~12nin后第32页/共61页2，SPO1早、中、晚期基因表达过程中σ亚基的替换（图8－16）（1）含σ55的RNA聚合酶全酶负责早期基因的转录早期基因产物gp28：分子量28KDa的σ亚基gp28取代σ55与核心酶结合，使RNA聚合酶识别中期基因的启动子不同σ亚基的替换取决与核心酶结合的亲和力第33页/共61页（2）含gp28的RNA聚合酶全酶负责中期基因的转录gp33、gp34表达，并取代gp28（以及σ55）与核心酶结合，使RNA聚合酶识别晚期基因的启动子第34页/共61页（3）以gp33-gp34为σ亚基的RNA聚合酶全酶负责晚期基因的转录第35页/共61页（二）枯草杆菌子孢子生成过程中σ亚基的替换第36页/共61页1，枯草杆菌不同生长时期σ亚基的替换（1）营养生长时期含σ55的全酶：识别营养生长有关基因的转录和孢子形成最初所需要的基因σ28含量很少σ32含量不到总量的1％第37页/共61页（2）营养耗竭及孢子形成反应时期含σ28的全酶：负责转录孢子生成的信号探测基因，以及起始孢子形成反应的基因第38页/共61页（3）孢子形成早期σ37代替σ55，含σ37的全酶能识别早期孢子形成基因的启动子σ32负责识别某些基因的启动子第39页/共61页（4）孢子形成中、晚期σ29代替σ37，含σ29的聚合酶负责中、晚期孢子形成基因的转录第40页/共61页2，不同σ亚基识别不同的启动子每种σ亚基识别的启动子都有各自的结构特征4，不同σ亚基的作用机制

σ亚基可能直接识别启动子的特性第41页/共61页二、T7噬菌体生长过程中用噬菌体RNA聚合酶代替寄主的RNA聚合酶（一）T7

噬菌体概况1，T7噬菌体的特点是感染大肠杆菌的烈性噬菌体由二十面体的头部和非常小的尾部构成基因组由39936bp的线状双链DNA组成，编码50个基因第42页/共61页2，T7

噬菌体生长周期生长周期：可分为早期阶段和晚期阶段，30C时为25分钟生长周期的特点：DNA注射非常缓慢，是基因调控的手段之一生长周期可分为早期阶段和晚期阶段第43页/共61页（二）T7

噬菌体的基因1，T7

噬菌体基因及其产物（1）早期及晚期基因（图8－19）早期基因及其转录产物I：第一组（早期）基因属于极早期基因，在噬菌体进入细菌后由宿主的RNA聚合酶表达。其产物中有干扰宿主基因表达的酶和噬菌体RNA聚合酶。后者负责部分早期和整个晚期基因的表达第44页/共61页晚期基因及其转录产物II：编码与DNA复制有关的蛋白质晚期基因及其转录产物III：编码与噬菌体颗粒的结构和组装有关的蛋白质第45页/共61页（2）T7

噬菌体基因的启动子位置和终止位点（图8－19）早期启动子：A1、A2和A3，由大肠杆菌RNA聚合酶识别第二组启动子：10个第三组启动子：5个复制启动子：ΦOL，ΦOR终止位点：TE，TΦ，T7末端第46页/共61页（3）T7噬菌体基因mRNA的合成及转录后处理（图8－20）T7噬菌体mRNA有宿主RNA酶III能够识别的发夹结构，可以被RNA酶III切割释放出各个基因的mRNA第47页/共61页2，T7噬菌体RNA聚合酶识别的启动子（表8－6）（1）T7噬菌体RNA聚合酶识别的序列23bp（-17~+6）的高度保守序列（2）T7噬菌体的弱启动子ΦOL，第二组启动子结构特点：有2~7个碱基不同于一致序列第48页/共61页（3）T7噬菌体的强启动子第三组启动子，ΦOR结构特点：与一致序列相同第49页/共61页（三）T7

噬菌体基因表达的调控1，早期转录产物I的形成（1）寄主RNA合成体系负责转录早期基因（2）重要的早期基因基因0.3：产物能抑制寄主的限制酶基因0.7：产物为蛋白激酶，能使宿主RNA聚合酶因磷酸化而失活基因1：产物为T7RNA聚合酶第50页/共61页2，第Ⅱ组基因的表达（1）基因2产物为宿主RNA聚合酶抑制剂（2）3.5基因产物参与DNA复制和转录的抑制同时也负责细胞的裂解（又称T7溶菌酶）第51页/共61页（3）T7噬菌体对寄主RNA合成体系的接管0.7，1，2基因产物作用的结果使宿主的转录体系关闭，噬菌体建立自己的转录体系第52页/共61页3，第Ⅲ类启动子的转录（1）可能由于基因3.5产物的作用，这个阶段转录水平下降（2）只有第III类强启动子才能起始转录第53页/共61页三、噬菌体早、晚期基因转录以及裂解生长和溶原生长的调控（一）噬菌体基因表达的特点1，对寄主RNA聚合酶的依赖性2，有多种调控因子3，功能相关的基因聚集形成4个操纵元第54页/共61页（1）早期左向操纵子：编码与噬