组织工程及其相关材料

关于组织工程及其相关材料第1页，共55页，2023年，2月20日，星期五8.1组织工程的基本概念和研究进展8．1．1组织工程学产生的背景（1）随着人类物质、文化生活水平的提高，对损伤、疾病的治疗要求越来越高，不仪要求治好伤、病，还要求良好的功能及完美的外形，应用传统的治疗方法难以达到如此完善的地步，需要寻找新的治疗途径。。当前修复缺损器官的主要方法：自体移植、异体移植、组织代用品（如假肢等。）问题点很多？？第2页，共55页，2023年，2月20日，星期五（2）细胞生物学技术的高速发展自从20世纪50年代以来：利用养分和酶已经将组织离解为有功能的细胞成分，体外细胞培养技术的研究也得到了长足的进步；使大规模细胞的培养成为可能；细胞组织类型培养技术的普及，以及对体外细胞作用的认识和理解，为重建有功能的组织成为可能；细胞生物学、生物分子、材料科学、临床医学及其生物工程等多学科的发展也为组织工程的建立奠定了坚实的基础。第3页，共55页，2023年，2月20日，星期五（3）巨大的市场需求为组织工程学发展注入了动力。众多的投资公司注入大量资本进行组织工程学研究。这些是组织工程学研究发展的基础与动力。第4页，共55页，2023年，2月20日，星期五8．1．2组织工程学原理组织工程的概念最早是由美国的RobertLanger和J.Vacanti在20世纪80年代中期提出的一个新的研究思路，即希望能够在一种可生物降解的支架材料上种植人体活细胞，使之在生长因子的作用下，再生成为组织。第5页，共55页，2023年，2月20日，星期五MaPeter，MaterialsToday.2004,7(5):30-40第6页，共55页，2023年，2月20日，星期五1987年，在美国国家科学基金会（NSF）的生物工程会议上提出了“组织工程（TissueEngineering)”一词。1988年NSF的一个专门工作小组对组织工程的内涵作了这样的定义：应用工程科学和生命科学的原理和方法，认识哺乳动物正常和病理组织与器官的结构-功能关系，并开发具有生物活性的人工替代物，以恢复、维持或改善组织、器官的功能。第7页，共55页，2023年，2月20日，星期五由此可见：组织工程是一个崭新的概念，它融合了工程学和生命科学的基本概念、基本理论、基本技术和基本方法,在体外将人体某部分的组织细胞种植和吸附在一种生物材料的支架上进行人工培养繁殖,扩增,然后移植到人体内所需要的部位,从而达到器官修复或再造的治疗目的的一种技术。组织工程是一门多学科交叉的边缘学科，虽很年轻，但是它将是21世纪最具有潜力的高技术产业之一，具有重要的社会意义和经济效益。第8页，共55页，2023年，2月20日，星期五8．1．3组织工程的关键技术组织工程这一概念的核心内容是：活的细胞；可以供细胞进行生命活动的支架材料；组织细胞与支架材料的相互作用（生长因子和生物细胞培养工程）。第9页，共55页，2023年，2月20日，星期五8．1．3组织工程的关键技术第10页，共55页，2023年，2月20日，星期五归纳：组织工程的内涵：组织工程学是综合应用工程学和生命科学的基本原理、基本理论、基本技术和基本方法，在体外预先构建一个有生物活性的种植体，然后植入体内，修复组织缺损，替代组织、器官的一部分或全部功能，或作为一种体外装置，暂时替代器官部分功能，达到提高生活、生存质量，延长生命活动的目的。这一内涵的核心是活的细胞、可供细胞进行生命活动的支架材料以及细胞与支架材料的相互作用，这是组织工程学研究的主要科学问题。一旦在体外能成功地制造出“组织”或“器官”，则通过医生的创造性劳动，将“组织”、“器官”植入人体，完成复制或修补人体组织、器官的艺术创作。第11页，共55页，2023年，2月20日，星期五应用于体外构建工程的组织、器官的细胞主要可以是自体细胞、同种异体细胞和异种细胞。其中自体细胞存在来源严重短缺的限制；异种细胞存在着移植排斥反应、传染动物源性病毒和伦理的制约；同种异体细胞同时也存在着来源有限和移植排斥反应等的问题。干细胞的研究为解决制约组织工程的细胞问题提供了一定的可能。（1）种植细胞的研究第12页，共55页，2023年，2月20日，星期五干细胞（StemCell）：是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下可以分化成多种功能细胞。分为：高度的增殖潜能（自我更新能力或自我维持能力）高度的分化潜能（可分化为多种组织）第13页，共55页，2023年，2月20日，星期五根据这一定义，在个体发育的不同阶段以及成体的不同组织中均存在着干细胞，只是随着年龄的增长，干细胞的数量逐渐减少，其分化潜能也逐渐变窄。在干细胞的发育过程中，还有一种中间类型的细胞称为祖细胞(progenitorcells)，祖细胞也具有有限的增殖和分化能力，与干细胞不同的是，祖细胞没有自我更新能力，它在经过几轮细胞分裂周期后产生的两个子代细胞均为终末分化细胞(terminaldifferentiatedcells)第14页，共55页，2023年，2月20日，星期五干细胞的分类按照发生学来源，干细胞可以分为胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESC)和成体干细胞(somaticstemcell)。根据不同的分化潜能，干细胞可以被分为全能干细胞(totipotentstemcell)、多能干细胞(pluripotentstemcell)、单能干细胞(unipotentstemcell)。第15页，共55页，2023年，2月20日，星期五干细胞的分类根据干细胞组织发生的部位进行分类。目前，已经从许多组织或器官中成功地分离出干细胞，其中包括：胚胎干细胞、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、成骨于细、内胚层干细胞、视网膜干细胞及胰腺干细胞等。第16页，共55页，2023年，2月20日，星期五根据个体发育过程中出现的先后次序不同，分为：全能干细胞，包括：胚胎干细胞（embryonicstemcells,ES细胞）生殖干细胞（embryonicgermcells,EG细胞）:具有全能性，能够分化成全身200多种细胞类型，进一步形成机体的任何组织和器官。

多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力。（在胎儿、儿童和成人组织中存在的多能干细胞统称“成体干细胞（Adultstemcell）”。第17页，共55页，2023年，2月20日，星期五胚胎干细胞

（Embryonicstemcell，ESC）从早期胚胎的内细胞群（Innercellmass，ICM）或原始生殖细胞（primordialgermcellsPGCS）分离出来的多潜能细胞系。它具有与早期囊胚ICM或PGCS相似的生物学特性，在体外能够保持正常二倍体核型和未分化状态，并且有多方向分化潜能，在适当条件下，ES细胞可被诱导分化为多种细胞、组织，也可以与受体胚胎嵌合，形成嵌合体。第18页，共55页，2023年，2月20日，星期五胚胎干细胞的优点

——全能性内细胞群的细胞可以发育成除了胎盘以外的完整个体，因而这些细胞被认为具有全能性。第19页，共55页，2023年，2月20日，星期五成体干细胞

（adultstemcell，ASC）成体干细胞是存在于成体动物的许多组织和器官，具有修复和再生能力的细胞。成体干细胞大多数时候处于静息状态。在正常生理条件下，它倾向于更新、并分化为所在特定组织的若干种细胞，保持生长和衰退的动态平衡。而在特殊条件诱导下，它能超越特定组织，或者按照一定的程序分化形成新的其他组织的功能性细胞，参与损伤组织的修复。第20页，共55页，2023年，2月20日，星期五成体干细胞的优点成体干细胞则可从患者自身获得，不存在组织相容性的问题。成体干细胞不会诱发畸胎瘤的发生。成体干细胞也不存在伦理学争执。第21页，共55页，2023年，2月20日，星期五成体干细胞的不足尚未从人体的全部组织中分离出成体干细胞.成体干细胞含量极微，很难分离和纯化，且数量随年龄增长而降低在一些遗传缺陷疾病中，遗传错误很可能也会出现于病人的干细胞中，这样的干细胞不适于移植成人身上获得的干细胞可能没有年轻人的干细胞那样的增殖能力由于日常生活中人是暴露在各种环境之下的，日光和毒素等都有可能造成基因突变，成体干细胞可能包含更多的DNA异常等等。第22页，共55页，2023年，2月20日，星期五现在研究比较集中的一些成体干细胞神经干细胞造血干细胞间充质干细胞骨及软骨干细胞心脏干细胞皮肤干细胞脂肪干细胞肠胃干细胞胰腺干细胞肝脏干细胞前列腺干细胞角膜干细胞气管干细胞血管内皮干细胞生殖干细胞肿瘤干细胞第23页，共55页，2023年，2月20日，星期五造血干细胞造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。造血干细胞易于分离纯化，其体外扩增和诱导分化技术已较成熟；体外在多种细胞因子联合作用下，能够大量扩增并可以向红系、粒系、巨核系等各类细胞定向分化。第24页，共55页，2023年，2月20日，星期五造血干细胞的临床应用急性白血病、慢性白血病、重型再生障碍性贫血、地中海贫血、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤等血液系统疾病还可用于治疗小细胞肺癌、乳腺癌、睾丸癌、卵巢癌、神经母细胞瘤等多种实体肿瘤。中华骨髓库中国干细胞网第25页，共55页，2023年，2月20日，星期五神经干细胞神经干细胞是中枢神经系统中保持分裂和分化潜能的细胞。神经干细胞可以进一步增殖、分化成中枢神经系统某些细胞类型。当移植入中枢神经系统后不具有免疫排斥反应第26页，共55页，2023年，2月20日，星期五干细胞技术应用1.疾病治疗研究干细胞增殖和分化机制的最终目的是应用干细胞治疗疾病。理论上讲，干细胞可以用于各种疾病的治疗，但其最适合的疾病主要是组织坏死性疾病如缺血引起的心肌坏死，退行性病变如帕金森综合症，自体免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病等。第27页，共55页，2023年，2月20日，星期五干细胞的应用涉及到医学的多个领域。目前，在干细胞生物学上已能在体外鉴别、分离纯化、扩增和培养人体胚胎干细胞、原始生殖干细胞以及多种组织干细胞。用干细胞治疗疾病的设想已进入实践检验。造血干细胞工程产品如骨髓、扩增及定向诱导分化的造血细胞和免疫细胞、转基因的基质细胞等，已经进入临床应用。造血干细胞移植已成为治疗白血病、各种恶性肿瘤放、化疗后引起的造血和免疫系统功能障碍等疾病的重要手段。第28页，共55页，2023年，2月20日，星期五2.体外制造人体器官干细胞和动物工程、生物载体材料等的结合将有可能解决这一问题。比如通过形成嵌合体，在严格的控制下，使动物的某些器官来源于人体干细胞。这些来自人体干细胞的器官可应用于临床移植治疗。第29页，共55页，2023年，2月20日，星期五又如，利用细胞培养技术和生物可降解载体材料的结合在体外人工控制细胞分化、增殖并生长成需要的组织，使之批量产出，用来修补由于意外损伤等引起功能丧失的体内组织，满足临床康复的需要，并有可能对一些目前尚无根治办法的疾病，如恶性肿瘤、帕金森病、中风等提供解决方案。以干细胞工程为代表的现代组织工程是一个迅速发展的新领域。第30页，共55页，2023年，2月20日，星期五体外克隆人体器官应用于临床移植治疗是干细胞研究的又一个重要方向。其目标是用病人的体细胞移植到去核的卵母细胞内，经过一定的处理使其发育成囊胚，再利用囊胚建立胚胎干细胞，在体外进行诱导分化成特定的组织或器官，再将这些组织或器官移植到病人身上。从理论上讲，利用干细胞技术，将从根本上解决同种异体器官移植过程中最难的免疫排斥反应问题，同时还较好地解决了组织器官的来源问题。第31页，共55页，2023年，2月20日，星期五（２）支架材料制备技术的研究支架在组织工程中的作用：为吸附在支架材料表面的细胞提供一个便于生存的三维空间，以利于细胞获得足够的营养物质和进行营养物资的交换，并能够排斥废物;（关键词：吸附、三维连通孔隙）为细胞的迁移、铺展、生长、分化和最终发育形成具有特定形态功能的器官或组织奠基。（关键字：材料的表面特性、降解性）第32页，共55页，2023年，2月20日，星期五组织工程支架材料的要求符合生物安全性要求合适的可生物降解吸收性合适的孔尺寸、高孔隙率和相连的孔形态特定的三维外形高表面积和合适的表面理化性质与植入部位组织力学性能相匹配的结构强度（关键技术：材料的设计、制备）第33页，共55页，2023年，2月20日，星期五支架设计及制备技术支架材料天然高分子材料合成降解聚合物生物陶瓷生物复合材料第34页，共55页，2023年，2月20日，星期五合成聚合物材料聚丙烯酸及其衍生物聚乙二醇及其共聚物聚乙烯醇聚交酯聚乳酸（PLA）聚（D,L-乳酸-co-乙醇酸）（PLGA）聚乙交酯（PGA）等第35页，共55页，2023年，2月20日，星期五其它形态支架的制备技术微球基质

静电液滴、乳化纤维支架

静电纺丝管状支架

无纺网粘合 溶剂流涎和挤塑第36页，共55页，2023年，2月20日，星期五在上述的各种制备技术中急需解决的是支架强度问题此外，对于一些合成的聚合物因其生物活性的其缺乏尚还需要进行必要的表面处理，而无机材料则没有此必要。第37页，共55页，2023年，2月20日，星期五生物材料的表面工程仿生表面工程（工程化生物材料表面引发特定的细胞生理响应，给细胞创造一个良好的人工ECM环境） 要求：良好的生物相容性；适宜的表面亲水－疏水平衡；具有较强的细胞识别功能；适宜的表面拓扑结构；可消除非特异性识别；易于加工和成型。第38页，共55页，2023年，2月20日，星期五第39页，共55页，2023年，2月20日，星期五第40页，共55页，2023年，2月20日，星期五一、培养细胞的生存条件（1）无污染的环境由于体内存在着强大的免疫系统和解毒器官（如肝等），对于入侵的有害物质可以进行防御和清除，使细胞免受危害。如果在体外细胞受到污染，则细胞就将凋亡。所以无污染的环境是细胞生存的首要条件。第41页，共55页，2023年，2月20日，星期五（2）基本的营养物质的保证培养细胞所需要的营养物质与体内的基本相同。体外培养细胞的营养是由细胞培养基提供的。培养液已经商品化，为培养细胞提供了极大的方便。（商品号如：RPMI1640、TC199、MEM等。由于各种细胞的培养条件的不同，在大多数的培养液中还需要添加血清（如小牛血清等），以提供包括生长因子在内的多种微量蛋白质成份等。或者也有直接添加生长因子或细胞因子的情况。第42页，共55页，2023年，2月20日，星期五（3）温度人和哺乳动物培养的细胞最适宜的温度是35～37℃，偏离此范围，细胞的正常代谢和生长就要受到到影响。细胞对低温的耐受力较高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢强度与温度成正比，温度低于0℃时，细胞代谢随温度降低而减慢，但是对细胞无伤害作用，一旦再放置于37℃培养，细胞还能够生长。若置于冰点以下，细胞将死亡，但是，若在培养液中添加保护剂（如甘油），封入安瓶中，即可在液氮中冷冻保存，复苏后还可以继续生长。第43页，共55页，2023年，2月20日，星期五（4）气体环境和氢离子浓度气体也是细胞生存的必要条件之一。所需的气体为氧气和二氧化碳。氧气参入三羧酸循环，产生能量供细胞的生长、增殖和合成各种物质。二氧化碳既是细胞代谢产物也是细胞所需要的成份，主要是与维持培养基的PH值有关。大多数细胞耐酸性强于耐碱性，在偏酸环境中更利于细胞生长。为维持培养基的PH值，常用CO2/HCO3-和磷酸缓冲溶液体系来完成。通常的培养基的PH值在6.8-7.2之间。第44页，共55页，2023年，2月20日，星期五（5）渗透压大多数细胞对渗透压有一定的耐受性。人血浆的渗透压为290mOsm/kg，可以视为培养基的理想渗透压。实验控制值的范围为：230－320mOsm/kg。第45页，共55页，2023年，2月20日，星期五二、培养细胞的类型与生命期（1）体外培养细胞的类型体外培养的细胞种类很多，主要的分类方法是根据细胞在培养皿中是否贴附支持物上生长性质分成两大类：贴附细胞：如成纤维细胞、上皮细胞、游走细胞等悬浮细胞：如淋巴细胞等。第46页，共55页，2023年，2月20日，星期五

（2）培养细胞的生命期

体内细胞处于动态平衡，其生存期与机体寿命相一致。但是从机体中取出后，培养细胞的生命期则与细胞的性状有关。在培养液中的细胞生命期为1年左右，传30－50代。细胞的全生存期分为：第一期原代或初代培养期：该期内的细胞与体内的细胞性状最相似，是最理想的实验材料第二期传代培养期指传代后的细胞系。此期最长，在传代30－50代后进入衰退期。为保持细胞的性质，细胞在传代早期需要冻存保种，如不冻存则会反复传代而可能丧失细胞二倍体性质。第三期衰退期在该期间细胞虽生存但是繁殖很慢或不繁殖，一致细胞衰亡。第47页，共55页，2023年，2月20日，星期五细胞株：在实际的研究过程中，由