食品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠的测定教案

9工程五 用高效液相色谱法检测物质任务一 食品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠的测定〔液相色谱法〕单元名称单元名称5-1-1液相色谱分别原理和液相色谱仪的根本组成授课班级授课时间4教学重点、难点解决方案其作用；难点：高效液相色谱的不同类型；解决方案液相色谱：教师引导，针对分析对象，描述样品各单元一 液相色谱分别原理和液相色谱仪的根本组成组分的分别过程。组分的分别过程。教学目标学问目标：了解果汁中防腐剂及糖精钠含量的测定方法；了解液相色谱法的分别原理；把握高效液相色谱仪的根本组成部件及其作用技能目标：高效液相色谱的不同类型；液相色谱法的流淌相配制。课后体会教学内容格外有必要的。表GB2760-2023食品分类号食品名称/分类最大使用量食品分类号食品名称/分类最大使用量备注/(g/kg)14.01.01碳酸饮料〔汽水〕0.2以苯甲酸计14.02.03果蔬汁1.0以苯甲酸计15.02配制酒0.2以苯甲酸计〔如人体外表或消化道〕，可以依据具体条件承受各种防腐剂〔如碘仿、水杨酸苯酯、苯胺染料或吖啶类色素等〕。25防腐剂应具备的几个条件：、性质较稳定：参加到食品中后在肯定的时期内有效，在食品中有很好的稳定性2、低浓度下具有较强的抑菌作用3、本身不应具有刺激气味和异味4、不应阻碍消化酶的作用，不应影响肠道内有益菌的作用防腐剂的作用机理：1、能使微生物的蛋白质凝固或变性，从而干扰其生长和生殖。2、防腐剂对微生物细胞壁、细胞膜产生作用。由于能破坏或损伤细胞壁，传递系统，从而具有抗微生物的作用。、作用于遗传物质或遗传微粒构造，进而影响到遗传物质的复制、转录、蛋白质的翻译等。4、作用于微生物体内的酶系，抑制酶的活性，干扰其正常代谢。高效液相色谱法概述(PaperChromatography)、薄层色谱(Thin-layerChromatography)和柱色谱(ColumnChromatography)。在(HighSpeedLiquidChromatography)、高效率液相色谱(HighEfficiencyLiquidChromatography)、高压液相色谱(HighPressureLiquidChromatography)和高效能液相色谱(HighPerformanceLiquidChromatography)。后一命名被广泛承受，缩写为HPLC。高效液相色谱法的特点用排阻色谱法来分析。30～40℃制备色谱来制备少量纯样品。lmm格外少，既降低本钱，又削减污染，但为协作微柱使用，进样装置、检测器以及泵都要小，仪器制造困难；⑧进展更通用、灵敏度更高的检测器。高效液相色谱固定相及流淌相固定相由于在液相色谱中，存在着组分与固定相和流淌相三者之间的作用力，因附色谱用的硅胶、氧化铝；安排色谱用的碳十八烷基、苯基、腈基、胺基等各种键合固定相；离子交换色谱用的离子交换剂等。在液相色谱中，用于键合固定液的基质材料主要是硅胶和苯乙烯交联共聚物。作为基质的硅胶主要分为薄壳型和全多孔型：薄壳型是由一个没有孔的坚碱。流淌相液相色谱流淌相可称为溶剂(Solvent)(Eluent(CarrierLiquid)]，与此相应被分别的物质称之为溶质(Solute)或洗脱物(Elute)。在给定固定相之后，溶质的保存以及物质对的分别，主要取决于所选定的相色谱；假设固定相的极性小于流淌相的极性，则称之为反相色谱。1.3 1.4.1液固吸附色谱法吸附色谱ndChromatography)。吸附一词可能更准确地反映这类分别过程的本质。吸附色谱是经典的色谱分别过程，固定相是吸附剂，流淌相是以非极性烃类为主的溶剂。溶质的分别取决于溶质与流淌相分子在吸附剂外表上的吸附竞常数不同而得到最终分别。液固吸附色谱由于传质快，装柱简洁，重现性较好，70年月前期曾得到广泛应用。其缺乏之处是试样容量小，需配用高灵敏度的检测器。液液安排色谱法Chromatography之所以能被分别的根本缘由。液液安排色谱依据固定相和流淌相的相对极性，可分为正相安排色谱和反相安排色谱两类。在正相安排色谱中，固定相的极性大于流淌相的极性，组分在柱内的洗脱挨次按极性从小到大流出。在反相色谱中，固定相是非极出，极性小的组分后流出。在很细的惰性载体上，可用于极性、非极性、水溶性、油溶性、离子型和非离子型等各种类型样品的分别和分析。离子交换色谱法离子交换色谱法(IEC液相色谱法，它是在60年月初期随着氨基酸分析的消灭而进展起来的，主要用于分别分析离子型化合物。体积排阻色谱法溶质分子在多孔填料外表上受到的排斥作用称为排阻 (Exclusion)假设组分的分别是由于分子大小而引起的，则称为SizeExclusionChromatography，这一类色谱的中文命名很不全都，如排阻、体积排阻、凝胶渗透、凝胶过滤色谱等。液-液安排色谱反相液相色谱分子量差异的同系物的分别。〔一〕流淌相〔与水不混溶〕。2．流淌相的使用原则无吸取。有些强疏水性样品即使承受100%乙腈仍无法洗脱，可承受更强的流淌相〔如四氢呋喃水或四氢呋喃乙腈〕。〔二〕固定相C18C8化合物时，也可以承受氨基、氰基等极性基团键合固定相。〔三〕反相色谱的分别机理性质。疏溶剂图示 疏溶剂理论模型会将非极性固定相上附着的溶〔吸附〕形成缔合物，并把溶质分子释放而被洗脱下来.固定相的选择流淌相的选择其它几种液相色谱分别类型名称分别原理固定相流淌相应用极性：硅胶〔酸性〕、氧化镁和硫酸镁分子筛等液固吸附色谱基于各组分对固定相吸附力量的差异非极性：高强度多孔微粒活性炭和多孔石墨化炭黑等选择要求：根本原则：极性大的试样用极性较强〔ε〕的流淌相，极性小的用低但数量不同的样品，还适用于分别异构体。正相：极性固定液非极性溶剂〔主体为己烷、庚烷，可参加<20%的极性改性剂〕〔非极性组分先，极性组分后〕〔〔极性组分先，非极性组分后〕GFC〔凝胶过滤色谱〕：水溶剂凝胶色谱依据分子尺寸大小的挨次来进展分别多孔性聚合材料谱基于离子交换树脂上可离解的离子与流淌相中具有一样电荷的溶质离子之间进展的可逆交换，学生练习：分别下述化合物，宜选用何种色谱方法？〔A〕聚苯乙烯相对分子量分布〔B〕多环芳烃〔C〕氨基酸〔D〕Ca2+，Ba2+，Mg2+A、B两物质，极性A＞B，问在两种液液安排色谱上的出峰挨次如何？高效液相色谱仪1019图 高效液相色谱仪流程示意图高压泵它输送的流淌相压力稳定，流速恒定(士1％)；耐高压(30～60MPa)，耐腐蚀，流量可调，适用于梯度洗脱等。恒压泵：输出压力恒定的泵。气源为高压气瓶。高压泵所输出的流淌流速欠稳定。恒流泵：输出流量恒定的泵，称为恒流泵。它所输出的流量不受色谱可保持流量恒定。常用的为螺旋泵和往复泵。高压无脉动的液流输出。当调整活塞的运动速度时，可使输出流量转变。这种泵可承受的压力一般在20～50MPa和压力指示。往复泵：常用的是柱塞往复泵。这种泵类似于打气筒，泵内体积小，输出流量恒定，适宜于梯度洗脱。但输出液脉动大，需加阻尼器。梯度洗脱装置梯度洗脱装置可分为高压梯度与低压梯度两种。高压梯度(或称内梯度)是按预先设计的程序分别用两台高压泵把两种溶剂输入一个混合器，待混合均匀低廉，使用便利。进样装置动进样器进样等。进样装置安装在进样口处，坏了可随时拆卸清洗、更换。先进的高效液相色谱仪都配有自动进样器，一般用于无人操作或样品数量便全部工作完成，自动报出分析结果。色谱柱色谱柱是高效液相色谱的重要部件，可用不锈钢管、氟塑料或玻璃管制成，色谱柱一般制成直形，便于填充与安装。长度一般30cm左右，内径l～4mm。其中内径2～3mm使用较多；小于lmm节约溶剂。检测器检测器是检测色谱柱分别过程中组分在流淌相中浓度的变化的重要部件，外光度检测器(UV(RI)(MAD)、氢火焰检测器(FID工程五 用高效液相色谱法检测物质任务一 酸、苯甲酸、糖精钠的测定〔液相色谱法〕单元二 液相色谱仪根本操作单元名称单元名称5-1-2 液相色谱仪根本操作授课班级授课时间4教学重点、难点 重点液相色谱仪的各掌握钮和工作站操作高效液相色谱仪解决方案难点：生疏液相色谱仪的各掌握钮和工作站。解决方案：教师指导，学生练习，讲练结合教学目标学问目标：液相色谱法的流淌相配制；生疏液相色谱仪的各掌握钮和工作站，操作高效液相色谱仪技能目标：生疏高效液相色谱仪的组成部件及其作用课后体会课后体会教学内容教师引入液相色谱仪的根本操作教师展现液相色谱仪操作的整个过程〔本过程以“教师现场演示”的方式进展教学，目的是让学生把握整个测定过程〕配制流淌相：甲醇/水〔85/15〕的流淌相1000mL，并进展过滤和脱气处理。把流淌相贮液器放置在略高于高压泵的位置，插入带有不锈钢滤芯的输液管更换色谱柱。设置流淌相比例、流量等参数。翻开高压泵的电源开关，翻开排放阀，“purge”1-2分钟，关闭“purge”，使仪器在设定的条件下平衡。翻开工作站，设置分析方法。3-5倍的苯试样(10μL分析纯苯试样，用甲醇稀释至50mL)，在上述分析条件下进样。记录下样品名对应的文件名，同时打印出经优化的色谱图和分析结果。〔制流淌相，一局部学生练习操作仪器。〕液相色谱仪的根本组成〔教师结合学生的练习，讲解岛津液相色谱仪的组成〕1、高压输液系统：贮液器和高压输液泵①贮液器②高压输液泵(Pump)力输送到色谱分别系统。第一、泵体材料能耐化学腐蚀；其次、能在高压〔30～60MPa〕下连续工作；第三、输出流量稳定〔±1%〕，无脉冲，重复性高〔±0.5%〕，而且输出流量两大类。③过滤器(Filter)过滤器的构造，2、进样系统路。常用的进样器有以下二种：①六通阀进样器谱仪中通常使用的是10μL，20μL体积的定量管。3、分别系统〔装柱时填充液的流向〕全都。色谱流淌相能按箭头所指方向流淌。分别条件要求有肯定的温度，因此，给色谱柱配一个柱温箱是格外有必要的。4、检测系统HPLC检测器是用于连续监测被色谱系统分别后的柱流出物组成和含量变化的成定性定量分析的任务。HPLC检测器一般分为两类，通用型检测器和专用型检测器。检测器包括紫外-可见光检测器和荧光检测器。5、数据处理系统(色谱工作站)机和色谱工作站来记录和处理色谱分析的数据。液相色谱的分析流程与气相色谱的分析流程有何不同？液相色谱仪与气相色谱仪的根本组成有何不同？3.7.1开机：翻开泵电源、设定流速、更换流淌相、平衡柱子30分钟；[Func]+“流速”+[enter]翻开检测器，设定波长；+[enter]+[CE]〔积分议〕，设定相关参数；3.7.2进样及数据采集数据处理及打印报告关机：3.7.3数据采集完毕即可关闭检测器;30分钟(如使用缓冲盐流淌相请先用水冲洗流路10分钟);关泵留意事项：HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。流淌相过滤后要用超声波脱气，脱气后应当恢复到室温后使用。不能用纯乙腈作为流淌相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必需用去离子水冲洗20ml以上。柱子，而应当用有机相(如甲醇等)，由于纯水易长霉。每次做完样品后应当用溶解样品的溶剂清洗进样器。C18柱确定不能进蛋白样品，血样、生物样品。查并清洗。清洗方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗；③用10％稀硝酸清洗。相的清洗。PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。的流淌相中。更换无互溶性的流淌相时要用异丙醇过渡一下。高效液相色谱的定性与定量分析方法与气相色谱法根本相像，所用的各种名词与参数也一样。〔联系气相色谱的定性〕1、利用标准样品定性气相色谱法中一样。2、利用检测器的选择性定性个检测器对被测化合物检测灵敏度比值是与被测化合物的性质亲热相关的。3、利用紫外检测器全波长扫描功能定性化合物的紫外光谱图。再通过比照标准谱图的方法来识别化合物。谱图，其定性结果与传统方法相比具有更大的优势。归一化法定量归一化法：归一化法要求全部组分都能分别并有响应，其根本方法与气相色谱中的归一化法类似。计算公式为wi=Ai/ AiHPLC方法的建立〔教师可引导学生对甲苯纯度测定方法予以分析〕一、理论型了解样品的根本状况〔官能团〕、分子量、pKa值、UV光谱图以及样品基体的性质〔溶剂、填充物等〕、化合物在有关样品中的浓度范围、样品的溶解度等。明确分别目的①主要目的是分析还是回收样品组分？②是否样品全部成分的化学特性，或是否需做定性分析？〔比方对映体、非对映体、同系物、痕量杂质〕？④如需做定量分析，周密度需多高？⑤本法将适用几种样品分析还是很多种样品分析？⑥将使用最终方法的常规试验室中已有哪些HPLC设备和技术？了解样品的性质和需要的预处理液相色谱分别前均需进展某种形式的预处理。检测器的选择最好有通用型检测器，以便能检测到混合物中的各种成分。应尽量使用紫外检测器〔UV〕，HPLC都配有这类检测器，它便利且受外界影响小。如被测化合物没有足够的UV生色团，则应考虑使用其他检测手段。上，确定高效液相色谱的分别模式。在高效液相色谱法作为分别方法中，有80%的物质的分别依靠反相色谱来完成。在反相色谱中，水是常用的流淌相弱组分，C18是常用的填充载体，重要的是选择流淌相的强组分，常用的强组分有甲醇、乙腈与四氢呋喃。二、阅历型节约人力、物力和财力，而且可以较快的完成任务。外标法定量外标法处理试验数据实例：本次试验数据的处理查阅中国药典和相关的质量标准〕分析中的污染及液相色谱仪的维护容器试验室常用的器皿有玻璃类、瓷类、石英类、塑料类等，在进展分析时，应依据试剂有杂质的试剂，则会消灭杂峰而影响测定结果。环境污染仪器室的有害气体、气溶液、灰尘等等都能造成污染，影响检测结果，这种污染留意防潮、防腐、防震、空气相对湿度应小于70%为宜贮液器①配制后的流淌相在使用前都应用0.45μm的滤膜过滤后才可使用，以保持贮液器的清洁；②用一般溶剂瓶作流淌相贮液器时应不定期废弃瓶子〔如每月一次〕，买来的专〔最终一次清洗应选用HPLC级的水或有〕。①用高质量试剂和HPLC级溶剂；②过滤流淌相和溶剂，溶剂使用前必需先经过脱气；③每天开头使用时放空排气，工作完毕后从泵中洗去缓冲液；进样器①对六通进样阀而言，保持清洁和良好的装置可延长阀的使用寿命；②进样前应使样品混合均匀，以保证结果的准确度；③样品瓶应清洗干净，无可溶解的污染物；不能弄直了连续使用；吸液时针头应没入样品溶液中，但不能遇到样品瓶底；统。色谱柱①在进样阀后加流路过滤器〔0.5μm烧结不锈钢片〕，挡住来源于样品和进样阀垫圈的微粒；低柱效能的化学“垃圾”。③色谱柱应避开突然变化的高压冲击；④色谱柱应在要求的pH值范围和柱温范围下使用，应使用不损坏柱的流淌相；⑤进样前应将样品进展必要的净化，以免进样后对色谱柱造成损伤；⑥每次工作完毕后，假设流淌相是水和有机溶剂系列，则用流淌相冲洗30分〔90∶10〕，然后再用纯甲醇冲洗20分钟并保存。检测器流淌相应过滤并脱气，不但能保证流淌池的清洁，还能保证基线的稳定。最正确分别条件的选择〕转变流淌相的比例，进展条件试验；转变流速，进展条件试验；记录下样品名对应的文件名，同时打印出经优化的色谱图和分析结果学生对测定过程提问、相互争论与教师的阶段总结〔本过程教师对学生的疑心进展解释〕在操作中，每转变一次流淌相比例，仪器均需平衡前方可进样。学生依据试验数据，每组得出苯、萘、联苯最正确的分别条件。全。〔教师分析液相色谱试验室内全部溶剂的危害性，以及试验室内可能存在〕影响分别度的因素〔教师可结合气相色谱的分别理论进展讲解〕影响分别的因素与提高柱效的途径在高效液相色谱中,液体的集中系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子集中项B/U较小，可以无视不计，即：HACu故液相色谱H-u曲线与气相色谱的外形不同，如下图。主要途径。柱温，影响不大。等梯度洗脱的根本分别度公式N:总的理论塔板数;柱效k’:容量因子(保存因子),色谱峰的保存作用a:色谱峰的相对分别程度;选择性作用容量因子与分别度选择性与分别度柱效与分别度〔pH是改善柱效的最直接的因素。作用拖尾并缩短分析时间。种类线性梯度：在某一段时间内连续而均匀增加流淌相强度。学生完成色谱柱的评价试验在选定的分别条件下，进展色谱柱的评价试验废液的处理必需有特地的容器。色谱柱性能的评价及操作条件。评价各种液相色谱柱的样品及操作条件下次课程问题格外有必要的，请参考国标设计方案检测果汁中的苯甲酸和山梨酸?并对选定的分析方法予以验证。工程五 用高效液相色谱法检测物质任务一 酸、苯甲酸、糖精钠的测定〔液相色谱法〕单元三 食品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠的测定单元名称单元名称5-2-1-3食品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠的测定授课班级解决方案授课时间难点：含量测定方法的验证4教学重点、难点解决方案：教师指导，学生练习，讲练结合教学目标学问目标：完成果汁中防腐剂及糖精钠含量的测定对该方法进展验证技能目标：完成果汁中防腐剂及糖精钠含量的测定课后体会教学内容问题：如何测定果汁中的防腐剂〔苯甲酸和山梨酸〕及糖精钠含量？〔上次课完毕后即布置并安排学生在课后查阅资料〕学生依据所查资料提出解决方案并进展现场争论，教师检查方案的合理性。〔教师参与争论，提出建议。〕如何验证该方案是合理可行的？〔查阅资料，参考试验室质量掌握，提出验证方案，教师讲解相关学问〕分析方法验证的内容标准比照品的浓度应与样品中所测定组分的量相全都。问题：如何验证本方案的可行性与准确性？灵敏度：工作曲线的斜率S＝dA或S=dm。检出限：能给出3倍标准偏差的吸光度所对应的待测元素浓度。Dc＝AC´3s回收率：用于评价方法的准确度，常用回收率表示回收率越接近100%方法越准确。〔学生争论，教师最终确立方案〕学生完成工程任务查阅资料，争论并汇总资料,确定分析方案；溶液配制〔流淌相、标准溶液等〕及果汁中防腐剂〔苯甲酸和山梨酸〕及糖精钠含量的测定试验结果集中展现学对他们的试验提出问题，进展评价，由组内成员解答。〔教师参与争论〕撰写方法验证的小论文原理不同样品经过提取后，将提取液过滤，经反相高效液相色谱分别测定，根据保存时间定性，外标准峰面积定量。试剂和材料GB/T6682甲醇：色谱纯乙酸铵溶液：称取1.54g乙酸铵，加水溶解并稀释至1.000ml经微孔滤膜过滤。106gK6Fe(CN)6·3H2O1000ml。220gZn(CH3COO)2·2H2O>溶于少量水中，30ml1000ml。氨水〔1：氨水与水等体积混合。正己烷。pH=4.4g2，用水溶解后定1000ml。4。3ml1000ml37：63pH=4.4pH=7.2A〕23.88g〔Na2HPO4·12H2O〕1000mlB〕gOl。7：3pH=7.2标准溶液的配制：0.2360g200ml1.00mg。GB/T23495——2023山梨酸标准储藏液：准确称取0.2680g200ml。1.00mg。D〕混合标准使用液：分别准确吸取不同体积苯甲酸、山梨酸和糖精纳含量为0.000mg/ml0.020mg/ml0.040mg/ml0.080mg/ml0.160mg/ml、0.320mg/ml仪器与设备4000r/min。超声波水浴震荡器。食品粉碎机。旋涡混合器。pH0.01g0.1mg。高效液相色谱