提取基因组和原理

关于提取基因组和原理第1页，共72页，2023年，2月20日，星期四破膜：释放出目的核酸分子分离：通过酶、有机溶剂、调节pH值、离心等手段得到粗制品纯化：去除杂质，纯化目的核酸。三个过程：

破膜、分离、纯化第2页，共72页，2023年，2月20日，星期四ULtraPureTMgDNA快速抽提试剂盒在高盐状态下，DNA纯化树脂ULtraPureTM专一性地吸附DNA;在低盐或水溶液状态下,DNA被洗脱下来第3页，共72页，2023年，2月20日，星期四二、试剂纯化树脂（于GN结合液中）GN结合液漂洗液离心纯化柱（空柱子）无水乙醇TE缓冲液：Tris-HCl（pH7.6)Tris:三羟甲基氨基甲烷EDTA（pH8.0)乙二胺四乙酸第4页，共72页，2023年，2月20日，星期四三、操作过程1、混匀全血，1ml树脂中加0.5ml全血,颠倒混匀5-6次。室温下温育3分钟，其间颠倒混匀1次，5，000rpm离心3秒，弃上清。2、加入1mlGN结合液，悬浮上述树脂，颠倒混匀，5，000rpm离心3秒，弃上清。3、取0.5ml漂洗液漂洗树脂两次,颠倒混匀，5，000rpm离心3秒，弃上清。第5页，共72页，2023年，2月20日，星期四如果树脂仍然呈黄色或褐色，重复3步1-2次。4、加入0.8ml无水乙醇,悬浮树脂,装入离心纯化柱,13,000rpm离心1分钟,倒掉乙醇,再离心1分钟,尽量除尽乙醇。5、将纯化柱套入一个干净的1.5ml离心管中，加100μlTE于纯化树脂上（不能粘在管壁上），室温下放置3分钟，13,000rpm离心2分钟。第6页，共72页，2023年，2月20日，星期四6、收集离心管中洗脱下来的gDNA，取2μl电泳（1%琼脂糖，120V，20分钟）检测。其余-20℃保存备用。注意：离心时保持平衡。7、紫外分光光度计测量核算的浓度及纯度。（测A260与A280值）第7页，共72页，2023年，2月20日，星期四实验前注意事项:1、所有微量离心管(eppdorf)、枪头（tip）必须高压灭菌。2、微量移液器的使用：看清刻度、轻旋、轻放。3、取不同的试剂、样品须更换tip。4、纯化树脂（于GN结合液中）为灰褐色粉状物质，静置时沉淀于瓶底，使用时要充分混匀。5、室温低于25℃时，纯化树脂与GN结合液可能出现结晶或盐析，请务必预热，完全溶解后使用。第8页，共72页，2023年，2月20日，星期四QuickGeneMini80与DNA全血试剂盒

一、样本抽提前仪器安装准备1正确安装好各个仪器配件，接上电源。2把试剂盒内的废液管、收集管和带膜的套管放在仪器配件的正确位置上二、DBS试剂盒第一次使用前准备工作1向EDB干粉中添加3.3ml无菌水，混匀室温静置30min2向WDB缓冲液中加入160ml无水乙醇第9页，共72页，2023年，2月20日，星期四

三、样本处理及血液基因组DNA纯化

1.取一新的15ml或50ml离心管，依次加入300mlEDB溶液、2ml全血、2.5mlLDB溶液

2.上下颠倒混匀10次，>2500rpm涡旋震荡15sec

3.56℃水浴5min

4.加入2.5ml无水乙醇

5.上下颠倒混匀10次，>2500rpm涡旋震荡15sec

6.将处理过的全血倒入QuickGene-610L的带膜的套管内

7.上机，第一次抽提选择模式“DNAWHOLEBLOOD”，按“start”开始

8.第二次抽提选择模式“INSOLUTIONA”

第10页，共72页，2023年，2月20日，星期四四、测DNA浓度与纯度五、将抽提好的DNA立即使用或保存于-20℃冰箱中，按实验室说明丢弃其他管子。第11页，共72页，2023年，2月20日，星期四PCR原理第12页，共72页，2023年，2月20日，星期四PCR定义:polymerasechainreaction，聚合酶链式反应.简单的说，PCR就是利用TaqDNA聚合酶对特定基因做体外或试管内(InVitro)的大量合成。基本上它是利用合成ＤＮＡ的TaqDNA聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。第13页，共72页，2023年，2月20日，星期四PCR的要件一、基本原理PCR技术是利用DNA聚合酶在体外条件下,催化一对引物之间特异DNA片段合成的基因扩增技术。包括三个基本过程：第14页，共72页，2023年，2月20日，星期四

DNA的变性(denaturation)：

在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。第15页，共72页，2023年，2月20日，星期四第16页，共72页，2023年，2月20日，星期四解链温度（融解温度，Tm）

(meltingtemperature)： 使50%的DNA发生变性时的环境温度。

DNA的变性从开始解链到完全解链是在一个相当窄的温度内完成的。第17页，共72页，2023年，2月20日，星期四第18页，共72页，2023年，2月20日，星期四增色效应：

DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。第19页，共72页，2023年，2月20日，星期四DNA的复性（renaturation)：

在适当条件下，变性DNA的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。

热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火(annealing)。第20页，共72页，2023年，2月20日，星期四第21页，共72页，2023年，2月20日，星期四减色效应：变性DNA复性后对260nm紫外光吸收减少的现象。第22页，共72页，2023年，2月20日，星期四1.常用的变性方法：

①热变性

②酸碱变性

③化学试剂变性

第23页，共72页，2023年，2月20日，星期四2.影响复性的因素

①序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA)识别快②DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢③离子强度↑→有利于复性④DNA浓度↑→复性↑

Tm值的估算①<20bpTm=4（G+C）+2（A+T）②>20bpTm=69.3+0.41(G+C)%③ Tm=81.5℃+16.6lgM+0.41（G+C）% -500/n-0.61×（甲酰胺%）

第24页，共72页，2023年，2月20日，星期四PCR的基本成分：1热稳定DNA聚合酶：催化模板依赖的DNA合成。热稳定DNA聚合酶的选择：主要依据合成大片段DNA产物需要的保真度、效率及合成能力而决定。常规PCR，TaqDNA聚合酶是常用酶。2一对引导DNA合成的寡核苷酸引物：设计目的：获得高产率的目的扩增物，抑制非特异序列的扩增。第25页，共72页，2023年，2月20日，星期四3脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准PCR反应体系中包含4中等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸。4二价阳离子：常用镁离子用于激活，适当增加镁离子可减少非特异性引导。5维持PH值的缓冲液：室温下标准缓冲液的PH值为8.3~8.8之间，72℃时反应体系的PH值下降1个多单位，PH值接近7.2。第26页，共72页，2023年，2月20日，星期四6一价阳离子：标准PCR缓冲液内包含有50mmol/LKCl，适于大于500bp长度的DNA片段。提高KCl浓度在70~100mmol/L，适于较短的DNA片段。7模板DNA：当使用高分子量的DNA（>10kb）做模板时，如用限制性内切酶先行消化（此酶不应切割靶序列）则扩增效果更好。第27页，共72页，2023年，2月20日，星期四基本PCR中寡核苷酸引物的设计原则：A碱基组成：G+C含量应在40%和60%之间，4种碱基在引物中分配均匀—没有多聚嘌呤或多聚嘧啶的序列，并且没有二核苷酸重复序列。B长度：引物中与模板互补的区域应该为18~25个核苷酸长度。上下游引物的长度差别不能大于3bp。C不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列存在。这种序列可形成发夹结构，如果这种结构在PCR条件下稳定，它会非常有效地阻止寡核苷酸和靶DNA之间的复性。第28页，共72页，2023年，2月20日，星期四D解链温度（Tm）：两个引物的Tm值相差不能大于5℃，扩增产物的Tm值与引物的Tm值相差不能大于10℃。保证扩增产物在每个PCR循环可有效变性。E3`末端：3`末端碱基最好是G或C，但不应是NNCG或NNGC。因为末端GC含量高可促进发夹结构的形成，还可能产生引物二聚体。F上下游引物的互补性：一个引物的3`末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，避免引物二聚体的形成和扩增。第29页，共72页，2023年，2月20日，星期四PCR温度条件的设计：1模板的热变性温度和时间：双链DNA模板的变性温度由其G+C含量决定。DNA分子越长，两条链完全分开所需的时间也越长。应用TaqDNA聚合酶时，变性一般在94~95℃下，这是TaqDNA聚合酶进行30或以上PCR循环而活力不致受到过多损失所能耐受的极限温度。第30页，共72页，2023年，2月20日，星期四2引物和模板DNA的复性：复性温度过高，寡核苷酸引物不能与模板很好复性，扩增效率降低；复性温度太低，非特异性DNA片段扩增增加。3寡核苷酸引物的延伸：常在热稳定DNA聚合酶的催化DNA合成的最适温度下进行。对TaqDNA聚合酶来说最适温度是72~78℃。第31页，共72页，2023年，2月20日，星期四PCR反应特点特异性强灵敏度高简便、快速对标本的纯度要求低第32页，共72页，2023年，2月20日，星期四特异性强关键：引物与模板的正确结合引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高第33页，共72页，2023年，2月20日，星期四PCR反应的特异性决定因素引物与模板DNA特异正确的结合；碱基配对原则；TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性

第34页，共72页，2023年，2月20日，星期四灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6)水平从100万个细胞中检出一个靶细胞在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)在细菌学中最小检出率为3个细菌第35页，共72页，2023年，2月20日，星期四简便、快速PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2~4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广

第36页，共72页，2023年，2月20日，星期四对标本的纯度要求低不需分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测第37页，共72页，2023年，2月20日，星期四热启动PCRTouch-downPCRRT-PCR兼并引物PCR巢氏PCR反向PCR不对称PCR原位PCR连接酶链反应RACE-PCRAFLP免疫-PCR(immuno-PCR)MSP甲基化特异PCR第38页，共72页，2023年，2月20日，星期四1）不对称PCR

目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针；基因组DNA结构功能的研究

PCR的类型第39页，共72页，2023年，2月20日，星期四

高浓度引物低浓度引物第40页，共72页，2023年，2月20日，星期四2)反向PCR(reversePCR)

用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。

未知序列未知序列已知序列第41页，共72页，2023年，2月20日，星期四已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶第42页，共72页，2023年，2月20日，星期四3）多重PCR（复合PCR）用于检测特定基因序列的存在或缺失。第43页，共72页，2023年，2月20日，星期四电泳引物12341234第44页，共72页，2023年，2月20日，星期四4）LP-PCR（Labelledprimers)利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记,用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分第45页，共72页，2023年，2月20日，星期四标记引物ＰＣＲ观察PCR产物第46页，共72页，2023年，2月20日，星期四5）锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）

锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3’锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增第47页，共72页，2023年，2月20日，星期四cDNA末端核酸转移酶3’GG…GG5’CC…CC锚定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC第48页，共72页，2023年，2月20日，星期四6）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR扩增探针亲和固相介质检测探针信号可用于基因芯片的制作第49页，共72页，2023年，2月20日，星期四7）原位ＰＣＲ原位聚合酶链式反应（InStillPCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列。第50页，共72页，2023年，2月20日，星期四操作步骤1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2.PCR扩增细胞内目的片段3.原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达第51页，共72页，2023年，2月20日，星期四8）ＲＴ－ＰＣＲ逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增第52页，共72页，2023年，2月20日，星期四9)荧光定量PCR（real-timePCR)

通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。内掺式染料 SYBRGreenI序列特异性探针 Taqman MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特异性探针

Amplifluor(Intergen)第53页，共72页，2023年，2月20日，星期四5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

第54页，共72页，2023年，2月20日，星期四实时荧光定量PCR仪梯度PCR仪普通PCR仪第55页，共72页，2023年，2月20日，星期四PCR的运用

PCR除了是一个诊断工具外，更重要的是它有广泛的运用。PCR本身可直接用来鉴定特定基因的存在与否，也可以用来侦测基因是否有异常(Genemutation,deletion,andrearrangement…)。例如，在医学上对遗传疾病或肿瘤癌症的诊断及预后的评估；对细菌、病毒及霉菌感染的诊断。它也可成为一个生产线进而大量复制特定的基因进行基因密码的读取(DNAsequencing)及其它的运用。第56页，共72页，2023年，2月20日，星期四举凡对生物标本及法医学上的样本鉴定，从单一毛发、一只精虫或一滴血液、唾液来找出凶手。也可以做DNA指纹(Fingerprints)比对帮助亲子关系的鉴定。PCR更可以用于器官移植组织兼容性HLA的分析。另外在演化上的分析，经由PCR的运用也产生重大的进展。近来，在生物医学的研究上，特别是细胞间讯息的传递分子，诸如介白质(Interleukines)及各种生长因子(Growthfactors)基因的表现都可用PCR来进行质与量的分析。第57页，共72页，2023年，2月20日，星期四凝胶电泳依据制备凝胶的材料，凝胶电泳可被分成两个亚类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。相比之下，琼脂糖凝胶在分离度上比聚丙烯酰胺差一些，而在分离范围上优于聚丙烯酰胺。一般，琼脂糖凝胶适用于分离大小在0.2～50kb范围内的DNA片段。

第58页，共72页，2023年，2月20日，星期四琼脂糖凝胶电泳一、基本原理：核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中（pH8.0-8.3)，其碱基不解离，而磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，向正极移动。不同大小和构象的核酸分子所带电荷量大致相同。在自由泳动时难以分开，采用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得分子大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离目的。第59页，共72页，2023年，2月20日，星期四二、主要试剂琼脂糖6X上样缓冲液（loadingbuffer）10mg/ml溴已锭(EB)10倍浓缩的TBE电泳缓冲液配方如下:Tris

108g

EDTA

9.3g

硼酸55g用蒸馏水定容至1000mL，调节pH为8.0～8.2备用，使用时需稀释10倍第60页，共72页，2023年，2月20日，星期四表1-1琼脂糖凝胶浓度与分离DNA分子大小的范围琼脂糖凝胶浓度(%)线型DNA分子的分离范围(千碱基对，kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～42.00.1～3第61页，共72页，2023年，2月20日，星期四电泳缓冲液是电泳场中的导体，它的种类、pH值及离子强度直接影响电泳的效率。常用的有Tris-醋酸（TAE）、Tris-硼酸（TBE）Tris-磷酸（TPE）。第62页，共72页，2023年，2月20日，星期四6X上样缓冲液（Loadingbuffer）组成：0.25%溴酚蓝、

0.25%二甲苯青、40%蔗糖作用：能够增加样品密度，确保DNA均匀沉入加样孔内；能够在电泳中形成肉眼可见的蓝紫色和蓝色指示带，从而帮助预测核酸电泳的速度和位置；能够使样品呈现蓝紫色，使加样操作更方便。

第63页，共72页，2023年，2月20日，星期四溴化乙锭（EB）（染色剂）核酸电泳后，需要染色才能在紫外线下观察到带型。溴化乙锭(EB)是一种荧光染料，有剧毒，因此操作时要非常小心。EB可嵌入DNA双链的碱基之间，在紫外线激发下能发出橙红色荧光，见光易分解,棕色瓶保存于4℃,使用终浓度0.5μg/mL。第64页，共72页，2023年，2月20日，星期四三、操作步骤1、选择合适的水平式电泳仪，调节电泳槽平面至水平，检查稳压电源与正负极的线路。2、用透明胶带纸将tank两端封好，选择孔径大小适合的梳板，垂直架于tank的一端。3、制备琼脂糖凝胶，称取适量琼脂糖，溶解在0.5XTBE中,置微波炉中加热,均匀溶解琼脂糖。第65页，共72页，2023年，2月20日，星期四4、加入EB（0.5μg/mL），摇匀，待凝胶冷却至50℃左右，倒入tank中，室温下冷却凝固。避灭产生气泡。5、撕去两端的透明胶带纸，将tank和凝胶一起放入电泳槽内。在电泳