高三生物二轮复习讲义非选择题专项突破5：借用实验设计思路破解生物工程题目

高三生物二轮复习非选择题专项突破借用实验设计思路破解生物工程题目【真题剖析】(2022·山东等级考)某种类型的白血病由蛋白P引发,蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解,药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理,需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一种短肽,连接在P或PΔ的氨基端,使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合,但不影响P或PΔ的功能。(1)为构建重组载体,需先设计引物,通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是,

为使PCR产物能被限制酶切割,需在引物上添加相应的限制酶识别序列,该限制酶识别序列应添加在引物的(填“3'端”或“5'端”)。

(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后,与编码FLAG的序列形成一个融合基因,如图甲所示,其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后,融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析,出现该问题的原因是

。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题,具体修改方案是

。(3)融合蛋白表达成功后,将FLAG-P、FLAG-PΔ、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质,分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测,检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-PΔ不能降解UBC,由①②③组结果的差异推测,药物A的作用是;由②④组或③⑤组的差异推测,PΔ中缺失的特定序列的作用是。

(4)根据以上结果推测,药物A治疗该病的机理是。

[答题模板]以实验设计的思路,梳理题目信息项目内容目的利用基因工程探索药物A治疗由蛋白P引发的白血病的机理原理①将P基因或P△基因插入含编码FLAG的序列的载体中,获得含融合基因重组载体,将该重组载体导入细胞后使其正确表达,即可获得融合蛋白。②利用抗原—抗体杂交技术检测,若样品中含有FLAG,它们就会被含FLAG抗体的介质滞留;用抗UBC的抗体检测介质中的UBC含量,若出现UBC的条带,说明FLAG-P或FLAG-P△能与UBC结合操作步骤(1)设计引物,利用PCR技术扩增P基因。设计的引物需能与P基因模板链的一段碱基序列互补配对(2)将P基因插入载体,与编码FLAG的序列形成融合基因。为了使P基因能与载体连接,需在引物的5'端添加限制酶识别的序列(3)将重组载体导入细胞并使其表达融合蛋白。由图甲可知,由于EcoRⅠ识别序列的添加,P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸,导致mRNA的密码子被错位读取。因此可在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基解决此问题(4)将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照不同组合分成图乙所示①~⑤五组,分别流经含FLAG抗体的介质,分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测,以此确定P是否能结合UBC,以及药物A对P与UBC结合的影响检测结果分析按照单一变量原则对图丙结果进行分析:①和②单一变量是有无FLAG,两组对比可知UBC能与P结合并通过FLAG滞留在介质处;②和③单一变量是有无药物A,两组对比可知药物A能促进UBC与P的结合;②和④或③和⑤的单一变量为是否缺失P中特定氨基酸序列,通过对比可知P中特定氨基酸序列参与P与UBC的结合结论药物A通过增强P与UBC结合促进P降解模板构建1.题目特点:此类试题往往为“任务驱动型”,围绕实现某一任务或实验目的过程中使用的工程技术、原理、以及最终结果分析和应用设置一系列问题。2.答题模板:此类试题中涉及的工程技术和原理一般为达成最终的目的服务,因此可借助实验设计的思路,梳理并理解题目中涉及的工程技术流程,并结合题目相关信息和工程技术原理进行分析作答。3.关键点:明确题目中为答成任务目标而涉及的工程技术、原理以及实验分析方法答案:(1)能与P基因母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸5'端(2)P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸,导致mRNA的密码子被错位读取在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基(3)增强FLAG-P与UBC的结合参与P与UBC的结合(4)通过增强P与UBC结合促进P降解[评分细则]规范答题不失分评分细则答题规则(1)4分。第一空2分,能与P基因母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。只答出“短单链核酸”得1分;第二空2分,5'端。(2)4分。第一空2分,P基因编码的第一个碱基(或A)与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基(或TC)编码一个氨基酸,导致的RNA的密码子被错位读取(其他相同含义的描述也可);第二空2分,在引物的EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基。(3)2分。第一空1分,增强(或加强、促进)FLAG-P(或P)与UBC结合;第二空1分,参与P与UBC的结合(作用)或P与UBC的结合(作用)位点。(4)2分。药物A通过增强P与UBC结合(作用)促进P降解,或答成药物A能促进药物P降解。其他答案不得分规则1.尽量使用课本中的语句作答。规则2.生物学名词要书写正确。规则3.答题要完整、全面。规则4.理由的得出应根据实验结果,并且答题符合逻辑【典例训练】1.某地中海贫血(TDT)是单基因病,严重时可能危及生命。人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点,该位点结合BCL11A蛋白后,γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列,解除对γ基因表达的抑制,可对TDT患者进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段,将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测,以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。(1)图中启动子是识别和结合位点,且启动子是具有方向性的,目的基因只有正确插入启动子和终止子之间才能正确表达。在表达载体中绿色荧光蛋白基因作为,要使绿色荧光蛋白基因表达出来,图b中还缺启动子,请判断即将插入的启动子方向(填“向左”或“向右”)。

(2)PCR扩增γ基因上游不同DNA片段的原理是,为使PCR反应体系中的模板解链为单链,需要满足的条件是。

(3)将扩增后的产物定向插入载体指导绿色荧光蛋白基因表达,需要在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知,在R末端添加的序列所对应的限制酶应为,在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是。

(4)从产物扩增到载体构建完成的整个过程中,除限制酶外,还必须用到的工具酶有DNA连接酶和,其中前者催化形成的化学键是。

(5)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是。

(6)向培养液中添加适量的雌激素,含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,而含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列,据此结果可推测,BCL11A蛋白结合位点位于

。

【解析】(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点,用于基因的转录。绿色荧光蛋白基因作为表达载体中的标记基因。要使绿色荧光蛋白基因表达出来,图b中还缺启动子,即将插入的启动子方向向左。(2)PCR扩增的原理是DNA双链复制。在体外利用PCR技术扩增目的基因时,利用DNA的高温变性加热至90~95℃,破坏双链之间的氢键,使DNA解链变为单链。(3)据图中对限制酶的注释可知,限制酶MunⅠ识别切割后的黏性末端与限制酶EcoRⅠ识别切割后的黏性末端相同,故R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ。在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ。(4)从产物扩增到载体构建完成的整个过程中,除限制酶外,还必须用到的工具酶有DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶,DNA连接酶作用的对象是磷酸二酯键。(5)只有扩增产物中含有完整的启动子,荧光蛋白基因才能表达,含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达。(6)向培养液中添加适量的雌激素,此时重组载体上的BCL11A基因表达,产生BCL11A蛋白,BCL11A蛋白与BCL11A蛋白结合位点结合后,导致荧光蛋白基因被抑制;含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,则说明BCL11A蛋白结合位点在引物F4与引物R之间的序列上,含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光,则说明BCL11A蛋白结合位点在引物F5的上游序列,故据此结果可推测,BCL11A蛋白结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。答案:(1)RNA聚合酶标记基因向左(2)DNA双链复制加热至90~95℃(3)EcoRⅠSalⅠ(4)耐高温的DNA聚合酶磷酸二酯键(5)F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达(6)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上2.金黄色葡萄球菌是食源性致病菌,随着抗生素的大量使用,金黄色葡萄球菌的耐药性越来越强,给临床治疗带来了极大的困难。已知金黄色葡萄球菌的耐盐性高,并能够利用甘露糖醇产酸,从而使溴麝香草酚蓝溶液变黄。某兴趣小组对生鲜肉中金黄色葡萄球菌进行了分离、鉴定,过程如图所示。(1)培养基的营养物质一般都含有等。高盐平板2能够鉴定金黄色葡萄球菌,则该平板与高盐平板1相比,还需添加,

并选取使培养基呈色的菌株进行保存或进一步实验。

(2)高盐平板2的接种方法是,用此方法计数时,所得的菌落数比活菌数目偏少,原因是。

(3)抑菌圈是指利用待测药物在琼脂平板中的扩散,使其周围的细菌生长受到抑制而形成的透明圈。为检测金黄色葡萄球菌的抗药性,将浸有不同抗生素且大小相同的纸片分别贴附在涂有金黄色葡萄球菌的平板上,培养一段时间后,结果如图所示。由图可知,该菌对抗生素(填序号)的抗性最强。如果隔一段时间后在抑菌圈中又长出少许菌落,分析其原因可能有(至少写出两种)。

【解析】(1)培养基的营养物质一般都含有水、无机盐、氮源、碳源。结合题意“金黄色葡萄球菌的耐盐性高,并能够利用甘露糖醇产酸,从而使溴麝香草酚蓝溶液变黄”可知,高盐平板2能够鉴定金黄色葡萄球菌,该平板属于鉴定培养基,故应添加甘露糖醇和溴麝香草酚蓝溶液;在该培养基上金黄色葡萄糖球菌可以利用甘露糖醇产酸从而使溴麝香草酚蓝溶液变黄,故应选取黄色的菌株进行保存或进一步实验。(2)据图可知,高盐平板2上的菌落均匀分布,该接种方法是稀释涂布平板法;稀释涂布平板法计数时,当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落,故用此方法计数时,所得的菌落数比活菌数目偏少。(3)据图可知,接种头孢唑林的培养基中的抑菌圈最大,即表明头孢唑林对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最强,而④氧氟沙星的抑菌圈最小,说明该菌对其抗性最强。如果隔一段时间后在抑菌圈中又长出少许菌落,原因可能是该菌产生了抗性突变;落入了杂菌;抗生素失效。答案:(1)水、无机盐、氮源、碳源甘露糖醇和溴麝香草酚蓝溶液黄(2)稀释涂布平板法当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落(3)④该菌产生了抗性突变;落入了杂菌;抗生素失效3.研究发现增强子是基因转录的调控序列,它可以位于基因的上游,也可以位于基因的下游。人肺特异性X蛋白基因(LUNX基因)仅在上颚、鼻咽和气管等呼吸道部位表达,可作为非小细胞肺癌诊断的标志物。为了研究LUNX基因的增强子是否具有促进基因表达的功能,以及其发挥作用的位置是位于基因的上游还是下游,科研人员首先通过PCR技术扩增了LUNX基因的3个增强子片段(E1~E3),然后分别连接到pGL3质粒中荧光素酶报告基因(Luc+)的上游或下游,最后通过检测荧光素酶的活性进行判断。(1)通过PCR扩增LUNX基因的增强子片段时,需要在反应体系中添加引物的原因是。扩增E1片段时,需选用图1中的引物,为了将E1片段与pGL3质粒相连,应在引物的端添加限制酶切割位点。

(2)构建含LUNX基因增强子的重组载体时,需要对通过(1)获得的PCR产物和图2中的pGL3质粒分别进行双酶切,这样做的目的是,最终构建出种重组载体。

(3)已知荧光素酶报告基因(Luc+)的表达强度越高,荧光素酶的活性越高,该实验中各组荧光素酶活性的检测结果如图所示。根据实验结果推测,在E1~E3中促进基因表达的功能最强。E1~E3发挥作用的位置不同之处在于

。

【解析】(1)通过PCR扩增LUNX基因的增强子片段时,需要在反应体系中添加引物的原因是耐高温的DNA聚合酶不能从头开始合成子链,只能从引物的3'开始子链的延伸。扩增E1片段时,结合子链延伸的方向以及目的基因的位置可确定需选用图1中的引物2和3,为了将E1片段与pGL3质粒相连,应在引物的5'端添加限制酶切割位点,从而为目的基因的切割做准备。(2)构建含LUNX基因增强子的重组载体时,需要对通过(1)获得的PCR产物和图2中的pGL3质粒分别进行双酶切,这样可以将E1~E3定向连接到Luc+的上游或下游,避免自连和反向连接,最终根据目的基因的种类和连接部位构建出6种重组载体。(3)题图中显示E1增强子位于下游时,荧光素酶活性最高,说明此时荧光素酶的表达量最大,因此可以推测,在E1~E3中,E1促进基因表达的功能最强,且在下游效果最好。根据相关数据可以看出,E1~E3发挥作用的位置不同之处在于E1和E2只在基因的下游时增强基因的表达,E3在基因的上游和下游时都能增强基因的表达。答案:(1)耐高温的DNA聚合酶不能从头开始合成子链2和35'(2)将E1~E3定向连接到Luc+的上游或下游6(3)E1E1和E2只在基因的下游时增强基因的表达,E3在基因的上游和下游时都能增强基因的表达4.β-1,3葡聚糖酶可以水解许多病原真菌细胞壁外层的β-1,3葡聚糖和几丁质,降解真菌细胞壁,从而抑制真菌的生长与繁殖。研究人员在植物中克隆到β-1,3葡聚糖酶基因(BG2)并转入苹果主栽品种,以减少苹果真菌病害、实现无公害生产。回答下列问题:(1)BG2的克隆可利用PCR技术,该过程需要一对特异性引物,引物是指

。

在体外对目的基因进行大量复制后,常采用来鉴定产物。

(2)如图为利用PATC940(由农杆菌Ti质粒改造获得)构建BG2抗病质粒的过程。图中右下处的酶为,人工设计的复合启动子的作用是。XbaⅠ酶切后片段与SpeⅠ酶切后的片段能进行连接的原因是。

(3)构建BG2抗病质粒完成后,首先将BG2重组抗病质粒导入农杆菌,该过程中需要用CaCl2处理农杆菌,目的是。研究人员将转入BG2抗病质粒的农杆菌与苹果外植体共培养,以进行遗传转化。目的基因BG2将随着T-DNA转移到被侵染的细胞而进入细胞,并随其整合到上。

(4)在完成遗传转化后,需要不断观察和检测转基因苹果植株在田间的生长状态,以确定目的基因是否赋予了苹果植株。【解析】