纯化的小熊猫重组IFN-γ免疫活性鉴定,动物学论文

纯化的小熊猫重组IFN-γ免疫活性鉴定,动物学论文干扰素(IFN-)由NK细胞、活化的Th1和细胞毒性T细胞(cytotoxicTcells,CTL)等细胞产生。IFN-的免疫学活性主要表如今如下几个方面:促进NK细胞活性;加强巨噬细胞递呈抗原及其杀菌功能;诱导活化的B细胞产生IgG2a和IgG3;通过上调转录因子T-bet表示出促进Th1的分化;通过抑制Th2分化,促进CTL活化,激活巨噬细胞等途径极化机体的细胞免疫功能;提高MHCⅡ类分子在抗原递呈细胞外表的表示出量;直接抑制病毒复制效应。因而,IFN-是天然免疫和适应性免疫应答经过中很重要的细胞因子之一,在机体抗细胞内寄生菌、抗病毒以及抗肿瘤中发挥着关键作用。基于此,人工制备重组IFN-并将其应用于动物传染病和肿瘤治疗,已经在兽医临床获得了较好的效果。人工舍饲养殖小熊猫经过中,因细菌、病毒和寄生虫等感染引起的小熊猫死亡问题一直令人感到棘手,至今未有较为合理有效的应对措施。本研究以纯化的小熊猫重组IFN-为材料,对其免疫活性进行鉴定,为小熊猫传染病及肿瘤的预防和治疗提供新的手段。1、材料与方式方法1.1材料1.1.1试验用动物成年健康小熊猫6只(2只雌性,4只雄性),饲养于海峡(福州)大熊猫研究沟通中心。1.1.2主要试剂淋巴细胞分离液为上海华精生物高科技有限公司产品;ConA、Hepes、L-Gln、MTT和丙酮酸钠为Sigma公司产品;RPMI-1640培养基为Hyclone公司产品;犊牛血清为Gibco公司产品;-巯基乙醇,DMSO为Amresco公司产品;青、链霉素,肝素锂抗凝管,小熊猫IFN-原核表示出蛋白(纯化后冻干),NaHCO3,NaCl,KCl,Na2HPO412H2O,KH2PO4均为进口或国产分析纯;辣根过氧化物酶标二抗(羊抗兔IgG-HRP),碳酸盐缓冲液,洗涤缓冲液(PBST),封闭液(含50g/L脱脂奶粉的PBST),终止液(2mol/L的H2SO4),96孔酶标板。1.1.3主要仪器水平转子离心机,角转子离心机(eppendorf),超净工作台,酶标仪(BIO-RAD),CO2培养箱(Thermo),恒温培养箱,普通光学显微镜,普通冰箱,-70℃超低温冰箱。1.2方式方法1.2.1小熊猫外周血单个核细胞悬液的制备前肢静脉无菌采小熊猫外周血3mL,肝素抗凝。将抗凝血沿离心管壁缓慢叠加到3mL淋巴细胞分离液上,注意尽量不要让血液与淋巴细胞分离液的分界面晃动。2000r/min离心20min。汲取云雾层细胞到另一干净离心管中,参加两倍体积的PBS(含20mL/L犊牛血清),温和颠倒混匀,1000r/min10min洗涤细胞,弃上清。重复洗涤细胞2次。最后一次洗涤结束后,弃掉上清,利用台盼蓝染色法染色,3min内计数,活细胞数目要求在95%以上。用完全1640培养基将细胞密度调整为1107个/mL。1.2.2淋巴细胞增殖试验汲取100L细胞悬液参加到96孔培养板中,试验组参加100L不同浓度(1001.56、10-11.56、10-21.56、10-31.56、10-41.56、10-51.56mg/mL)的小熊猫IFN-原核表示出蛋白或经热变性处理(煮沸10min)的小熊猫IFN-原核表示出蛋白(10-11.56mg/mL)。对照组参加100L的完全1640培养液。37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养72h。细胞培养至68h时,每孔无菌汲取50L上清弃掉,参加15LMTT。37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中继续孵育4h。细胞培养72h时,每孔汲取100L上清弃掉,参加100LDMSO彻底裂解细胞,用酶标仪在490nm波长处测OD值,计算SI值,确定出最佳刺激效果的稀释梯度。1.2.3PBMC培养上清的制备分离小熊猫外周血单个核细胞(periphalbloodmononuclearcells,PBMC),步骤同1.2.1,用完全1640培养基将细胞密度调整为1107/mL。汲取500L细胞悬液参加到24孔培养板中,再参加500L浓度为10-11.56mg/mL的小熊猫IFN-原核表示出蛋白溶液,另设PBMC阴性对照。37℃、体积分数为5%CO2培养。分别在刺激后12、24、36、48、60、72h收取细胞上清,置-80℃保存,供IFN-测定使用。1.2.4IFN-的间接ELISA测定1.2.4.1抗原包被不同时间收集的PBMCs培养上清冻干粉,用等量的碳酸盐缓冲液(pH9.6)溶解,然后以100L/孔包被,另设相应的对照孔。4℃过夜,弃去包被液,用PBST洗5次。1.2.4.2封闭每孔参加100L含50g/L脱脂奶粉的PBST,37℃,孵育1h。弃去封闭液,PBST洗涤5次。1.2.4.3加一抗用PBST将兔抗IFN-血清稀释1000倍,每孔参加100L,37℃,孵育1h。弃去孔中液体,PBST洗涤5次。1.2.4.4加二抗羊抗兔IgG-HRP用PBST稀释成1∶5000,每孔参加100L,37℃孵育50min。弃去孔中液体,PBST洗涤5次。1.2.4.5每孔参加100L的底物显色液,37℃孵育15min。1.2.4.6终止参加2mol/L的H2SO4终止反响,测OD450nm值。2、结果2.1重组IFN-对小熊猫PBMC增殖的影响本研究结果显示,浓度组为10-11.56mg/mL、10-21.56mg/mL的小熊猫IFN-原核表示出产物与小熊猫外周血T淋巴细胞共孵育后,具有显著刺激T淋巴细胞增殖的效应(P0.05)。为进一步明确这种细胞增殖效应是IFN-本身的免疫活性引起的,而非IFN-作为一种抗原性质的作用。我们对IFN-原核表示出产物进行了蛋白热变性处理,结果发现浓度为10-11.56mg/mL的IFN-经热变性处理后,与空白对照组相比,其淋巴细胞增殖效果无显著差异(P0.05),但与未经热变性处理组相比,淋巴细胞增殖效果显著降低(P0.05)。本试验结果表示清楚,我们制备的小熊猫IFN-原核产物具有刺激T淋巴细胞增殖的免疫活性,经热变性处理的小熊猫IFN-刺激T淋巴细胞增殖的活性几乎完全丧失(图1和图2)。2.2重组IFN-对小熊猫PBMC分泌IFN-的影响本试验测定了PBMC在重组IFN-作用下,不同时间点培养上清中IFN-的水平。结果显示,与对照组相比,试验组IFN-含量在60h之前均显著升高(P0.01,或P0.05)。与对照组相比,IFN-含量在培养72h时的水平并没有显著变化(P0.05)。结果表示清楚,IFN-原核表示出产物具有刺激小熊猫外周血淋巴细胞分泌IFN-活性。PBMC培养系统参加的重组IFN-在短期内(24h)迅速激活Th1和CTL细胞并分泌IFN-,之后随着培养时间延长,效应T细胞活力下降,其分泌能力随之下降并停止。加之IFN-则在酸性环境不稳定,故而累积在上清中的IFN-则随时间延长而不断衰减,导致培养后期培养上清中IFN-水平下降(图3)。3、讨论外周血单个核细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞以及单核细胞,经过淋巴细胞分离液分离后获得的PBMC主要包括T、B淋巴细胞和极少量的NK细胞。T细胞由Th1、Th2、CTL、Th17等组成,华而不实Th1、CTL等T细胞的活化分化均需要IFN-。换言之,IFN-在细胞培养水平具有刺激T细胞增殖的效应,并且这种作用在一定范围内呈量效正相关的关系。活化以及效应Th1和CTL又具有分泌IFN-活性,在其培养上清中又能够检测到IFN-,并且上清中IFN-水平的高低与活化以及效应Th1和CTL数量严密相关。基于上述免疫学原理,本研究采用PBMC增殖试验和间接ELISA,分别测定了重组IFN-刺激小熊猫PBMC增殖及其培养上清中IFN-含量,以此断定小熊猫原核重组IFN-的免疫活性。本研究在IFN-活性时之所以不选择动物个体水平试验,基于两个原因:小熊猫属于国家珍稀保卫动物,数量有限;正常小熊猫个体使用重组IFN-效果未必明显,病毒感染或荷瘤小熊猫样本短时间内难以获得。除此之外,也有研究采用IFN-直接抗病毒增殖的特点,通过测定其在细胞培养水平抑制病毒增殖效果来评估的活性。作为免疫活性细胞因子,其更重要更明显的活性是具体表现出在其免疫学方面,这也是本研究不测定重组IFN-抗病毒增殖活性的原因。本研究结果表示清楚,纯化的小熊猫重组IFN-具有较好的免疫活性,能够刺激小熊猫T淋巴细胞增殖及促进其分泌IFN-。从培养上清中IFN-含量分析,在12h时含量就已经明显升高,提示在这个时间点产生细胞已经充分活化。换言之,我们在培养系统中参加的重组在12h之前就已经发挥了其刺激T细胞增殖的作用,这和我们前期预试验在12h就能够观察到PBMC有细胞大量增殖构成的克隆团现象恰好吻合。由于一般的蛋白质抗原在PB-MC细胞培养系统中刺激淋巴细胞增殖构成克隆团现象通常需要24h,因而,本研究结果充分表示清楚,我们制备的小熊猫重组IFN-具有很好的免疫活性。为进一步证实这一结论,我们对小熊猫重组IFN-根据蛋白质热热变性条件进行处理,再将热变性的重组IFN-参加到PBMC培养系统中,结果显示其刺激细胞增殖的活性消失。表示清楚重组IFN-活性的发挥需要特定空间构象的维持,这与天然IFN-活性需要特定构象的特性相一致。本研究结果证明,一旦该重组细胞因子的空间构象被毁坏,其免疫活性也就随之丧失。这一结论为下一步制备供小熊猫临床应用的重组IFN-提供了极有参考价值的根据。人类I