病原生物与免疫学实验教材 实验六教学课件

实验六

白喉杆菌、厌氧菌、分枝杆菌

病毒及其它微生物实验内容操作白喉棒状杆菌（吕氏血清斜面）：Albert染色法病毒血凝试验示教破伤风梭菌及产气荚膜梭菌的培养特性结核分枝杆菌的培养特性病原性真菌形态、培养特性血凝抑制试验示教片：观察结核分枝杆菌、钩端螺旋体、新型隐球菌和病毒包涵体的形态目的要求熟悉白喉棒状杆菌的形态熟悉结核分枝杆菌的形态和培养特性熟悉破伤风梭菌及产气荚膜梭菌的培养特性了解病原性真菌形态和培养特性掌握钩端螺旋体、病毒包涵体的基本形态了解恙虫病立克次体的基本形态了解病毒血凝试验、血凝抑制试验的方法，掌握基本原理Albert染色法制片同革兰染色，甲液染5分钟→水洗→再以乙液（碘液）染1分钟→水洗→印干→油镜检

白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)Albert染色：见异染颗粒，菌体蓝绿色，异染颗粒蓝黑色（用于鉴定）病毒的血凝试验血凝素（hemagglutininHA）：由病毒基因编码的糖蛋白刺突。与病毒吸附和传入宿主细胞有关。HA能与人或其它动物多种红细胞表面N－乙酰神经氨酸酶受体结合引起红细胞凝集。滴定病毒的血凝效价，采用一定的病毒量，通常采用4个血凝单位。孔号123456789生理盐水（ml）病毒液（ml）0.9+0.10.5+0.50.5+0.50.5+0.50.5+0.50.5+0.50.5+0.50.5+0.50.50.5弃掉病毒稀释度1∶101∶201∶401∶801∶1601∶3201∶6401∶1280对照鸡红血球细胞悬液（ml）各0.5ml血凝试验（血凝效价的滴定)将有机玻璃板孔从1~9进行编号，从第1孔起至第9孔，按下表加。将病毒液按下表进行稀释。自第9孔开始反方向向前每孔加入0.5%鸡红血球0.5ml，摇匀后放置室温45分钟血凝试验结果判定结果判定：薄层（凝集）圆点（不凝集）凝集特别显著：“＋＋＋＋”凝集现象次之：“＋＋＋”凝集清楚可见：“＋＋”稍显凝集者：“＋”血凝单位：呈“＋＋”凝集时的最高稀释度。此时的稀释度即为1个血凝单位。血平板庖肉培养基牛奶培养基破伤风梭菌37℃48h，薄膜状爬行生长物，边缘不齐，伴轻度β溶血肉汤混浊，肉渣部分被消化，呈灰白色产气荚膜梭菌菌落平整，光滑，边缘齐。有双层溶血环：内层完全溶血(θ毒素引起)，外层不完全溶血(α毒素引起)分解肉渣中糖类而产生大量气体。分解乳糖产酸，指示剂变黄，培养基凝固,产生大量气体,呈蜂窝状,将液面凡士林上推,甚至冲走管口棉筛。“汹涌发酵”示教：破伤风梭菌及产气荚膜梭菌的培养特性的培养特性示教：结核分枝杆菌的培养特性专性需氧，最适37℃，营养要求高，生长缓慢，18h分裂一代。罗氏(Lowenstein-Jensen)培养基含蛋黄、甘油、马铃薯、无机盐、孔雀绿，2~6周可见菌落生长菌落特点：菜花、颗粒或结节状菌落，乳白色或黄色，不透明。黄曲霉示教：真菌的培养特性多细胞真菌：观察气生菌丝，营养菌丝，表面隆起，浅沟及菌落基底颜色。单细胞真菌：酵母型菌落新型隐球菌：菌落圆形，较大，湿润呈蜡状，乳白色类酵母型菌落白假丝酵母菌：：菌落圆形，较大，白色菌落底层有假菌丝原理病毒引起的血凝现象能被相应的抗血凝素抗体所抑制，称血凝抑制。利用血凝素特异性抗体与病毒表面相应的HA相互作用，使病毒血凝现象抑制的试验称血凝抑制试验。4个血凝单位的病毒液血凝抑制试验血凝抑制试验结果判定测定孔：圆点（不凝集）薄层（凝集）血清对照孔：圆点（不凝集）病毒对照孔：薄层（凝集）RBC对照孔：圆点（不凝集）血凝抑制试验效价：呈完全血凝抑制的最高血清稀释度。

抗酸染色法(acid-faststain)：以5％石炭酸复红染色，再用3％盐酸酒精脱色，然后用美蓝复染，则分枝杆菌呈红色(+)，其他细菌和背景物质为蓝色(-)。实验过程：取痰液→涂片（略厚）→干燥→固定→石炭酸复红染色8~10分钟后→用3%的盐酸酒精脱色约1~2分钟，脱色时轻摇玻片，直到涂片颜色脱去为止→水洗后，用碱性美蓝复染1分钟→水洗，印干→镜检结核分枝杆菌抗酸染