微生物第六章大肠杆菌二

第二节埃希菌属

Escherichia

人类和动物肠道中的正常菌群出生后数小时就进入肠道，并终生伴随一、分类：大肠埃希菌（E.coli）：最常见的临床分离菌蟑螂埃希菌弗格森埃希菌赫尔曼埃希菌伤口埃希菌（一）致病因素：1.侵袭力：K抗原：抗吞噬、抗补体、抗体作用菌毛：定植因子，黏附作用2.内毒素：3.肠毒素：不耐肠毒素（LT）耐热肠毒素（ST）4.志贺样毒素（EHEC产生）二、临床意义：

(二）所致疾病

正常菌群，一般不致病两大原因可以致病1.条件致病细菌居住部位改变引起的肠外感染：泌尿系统感染：尿道炎、膀胱炎、肾盂肾炎败血症婴儿脑膜炎2.致病菌株

(1）肠道外致病性大肠杆菌(ExPEC):通过其特有的毒力因子（菌毛、黏附素、细胞表面亚基、侵袭因子、铁相关蛋白、毒素等）侵袭、定植于肠外组织，并诱发感染

①尿道致病性大肠埃希菌(UPEC):②脑膜炎/脓毒症相关大肠埃希菌（ＭＮＥＣ）:(2）致泻性大肠埃希菌：某些带有致病基因的血清型，引起肠道感染美国临床数据显示:由革兰阴性菌引起的新生儿脑膜炎中50%是ExPEC造成的在泌尿道的感染中70%～90%是ExPEC所致

引起肠道感染的大肠埃希菌分为五类：①肠毒素大肠埃希菌（enterotoxigenicE.coli,ETEC）②肠致病型大肠埃希菌（enteropathogenicE.coli,EPEC）③肠侵袭型大肠埃希菌（enteroinvasiveE.coli,EIEC）④肠出血型大肠埃希菌（enterohemorrhagicE.coli,EHEC）⑤肠凝聚型大肠埃希菌（enteroaggregativeE.coli,EAggEC）肠产毒型大肠埃希菌

(enterotoxigenicE.coli,ETEC)

致病物质肠毒素enterotoxinheatlabileenterotoxin(LT)heatstableenterotoxin(ST定植因子(菌毛）婴幼儿、旅游者腹泻，与霍乱相似，水样便肠致病型大肠埃希菌

(enteropathogenicE.coli,EPEC)婴幼儿腹泻:水样或蛋花汤样便致病机理粘附和破坏肠粘膜微绒毛上皮细胞排列紊乱，功能受损，导致腹泻肠侵袭型大肠埃希菌

(enteroinvasiveE.coli,EIEC)致病机理侵袭结肠粘膜上皮并繁殖细菌死亡后释放内毒素，引起炎症成人腹泻，与菌痢相似，有脓血便，有里急后重肠出血型大肠埃希菌

(enterohemorrhagicE.coli,EHEC)亦称为Vero毒素大肠埃希菌血清型主为O157:H7致病因子菌毛毒素Vero毒素内毒素与溶血素临床表现轻重不一出血性结肠炎

10%小于十岁患儿，有严重并发症，溶血性尿毒综合征（HUS）等死亡率高肠集聚型大肠埃希菌

(enteroaggregativeE.coli,EAggEC)致病因子肠集聚耐热毒素（EAST）

婴儿腹泻三、微生物学检查（一）生物学性状：1、共性：2、个性：1)革兰阴性杆菌，无规则散在排列2)荚膜或微荚膜(部分菌株)和周身菌毛3)培养特性：兼性厌氧、营养要求不高液体培养基呈混浊生长

NA:较大、圆形、光滑、湿润、灰白色菌落

Mac:可发酵乳糖，形成有色菌落

EMB平板：菌落呈金属光泽蓝紫色大肠埃希菌革兰染色图图1：大肠埃希菌普通平板上菌落图2：大肠埃希菌EMB平板上菌落图3：大肠埃希菌Mac平板上粉红色菌落1234)、发酵葡萄糖产酸产气

KIA结果：AA+—MIU结果：++—IMViC结果：++——

大肠埃希菌KIA（AA＋－）MIU（＋＋－）动力及尿毒酶试验大肠埃希菌奇异变形杆菌指示剂：酚红大肠埃希菌对照-吲哚试验枸椽酸盐利用试验大肠埃希菌甲基红试验VP试验大肠埃希菌大肠埃希菌对照-对照+对照+结果；

IMViC试验（＋＋－－）

3、抗原结构：O抗原：171种H抗原：56种K抗原：100种大肠埃希菌血清型：按O:K:H的顺序，以数字表示

O111∶K58∶H2O157∶H7（二）实验室检查一）标本采集根据不同感染部位采集不同标本肠外标本有尿液、血液、脓液、创口渗出液、脑脊液、痰等

泌尿系统除确定大肠杆菌外，还应计数，每毫升尿含菌量≥10时，才有诊断价值

腹泻病人取粪便、肛拭标本53）、检验方法：①涂片、染色、镜检：肠外标本②分离培养：肠道标本:接种弱选择培养基肠外标本:接种血平板与弱选择培养基标本量较少先用肉汤增菌

③鉴定：

：主要根据生化反应和血清学鉴定初步鉴定：菌落特征可疑菌落涂片、染色、镜检挑取可疑菌落做生化反应：

IMViC++-

-，脲酶阴性，KIA上发酵葡萄糖产酸产气，大多数分解乳糖，硫化氢阴性，动力阳性，可初步鉴定为大肠埃希菌微生物学检验最终鉴定：全面生化反应亦可用肠杆菌科诊断试剂盒埃希菌属内各菌种的鉴别微生物学检验血清学试验：

一般不做仅作为肠内感染的大肠埃希菌鉴定手段之一引起腹泻及肠道感染的大肠埃希菌血清型1）ETEC的检测

分离培养+生化反应+血清学分型+肠毒素测定生化反应符合大肠杆菌特征；血清学鉴定符合ETEC血清型；（可不做）检出大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）和／或耐热肠毒素（ST）：目前临床主要采用ELISA法的商品试剂盒报告产毒大肠埃希菌应有肠毒素试验的结果

2）EPEC的检测：

分离培养+生化反应+血清学分型生化反应符合大肠杆菌特征；血清学鉴定符合EPEC血清型：O多价血清（+）呈阳性的多价血清中的各单价血清做玻片凝集确定血清型H抗原测定报告肠致病性大肠埃希氏菌应有血清学试验结果多价血清名称检测的血清型多价1(EPEC)O1，O26，O86，O111，O119，O127，O128多价2(EPEC)O44，O55，O125，O126，O146，O166多价3(EPEC)O18，O114，O142，O151，O157(EHEC)，O158多价4(ETEC)O6，O27，O78，O148，O159，O168多价5(ETEC)O20，O25，O63，O153，O167多价6(ETEC)O8，O15，O115，O169多价7(EIEC)O28，O112ab，O124，O136，O144多价8(EIEC)O29，O143，O152，O164多价9O45(ETEC)，O85(ETEC)，O149(ETEC)，O88(EPEC）O113(EHEC)，O117(EHEC)多价10(STEC)O91，O118，O138，O1453）EIEC的检测：

分离培养+生化反应+血清学分型+毒力试验

生化反应结果：发酵葡萄糖产酸不产气，不发酵或迟缓发酵乳糖，除O124外无动力，赖氨酸脱羧酶阴性。血清学鉴定符合EIEC血清型；豚鼠眼结膜试验阳性：可疑EIEC菌落豚鼠眼结膜

与志贺菌鉴别！报告性大肠埃希菌应有豚鼠角膜试验和血清学试验的结果EIEC的检测多数EIEC动力阴性，不发酵或迟缓发酵乳糖应与志贺菌属相鉴别

醋酸钠利用试验葡萄糖铵利用试验粘质酸产酸试验EIEC+++志贺菌属--

-葡萄糖铵盐试验

阳性：黄绿色阴性：蓝色

4）EHEC的检测：目前最具代表性的是O157：H7一个血清型

分离培养+生化反应+血清学分型生化反应：符合标准大肠埃希菌，迟缓发酵山梨醇，在山梨醇麦康凯琼脂平板上无色菌落；血清学鉴定：O157和H7抗血清做玻片凝集和试管凝集试验，其血清型为O157：H7

志贺毒素鉴定:PCR

曾在世界范围内多次爆发流行许多国家将O157∶H7当作传染性病原菌进行监测疑为O157:H7感染的标本应使用山梨醇麦康凯琼脂，35℃培养24~48h选择无色菌落进行毒素测定。O157:H7山梨醇麦康凯琼脂O157:H7麦康凯琼脂O157:H7EIEC的检测E.coliO157:H7ID显色培养基典型菌落O157：H7墨绿色菌落血液、脑脊液、中段尿（计数细菌）、胆汁、脓液、痰、分泌物（除脓、痰外均需肉浸汤增菌培养）革兰染色镜检血琼脂MAC35℃18～24h挑选可疑菌落初步鉴定：革兰染色、菌落特征、氧化酶试验IMViC、KIA、MIU最终鉴定：系统生化反应结果报告二）检验程序1、肠外感染粪便、直肠拭子MACEMBETEC：血清学鉴定肠毒素测定报告检出或未检出ETECEPEC、EIEC、EHEC：菌落与分组O多价血清作玻片凝集不凝集强凝集报告未检出EPEC或EIEC或EHEC血清学分型等结果报告35℃18～24h挑选可疑菌落初步鉴定：革兰染色菌落特征氧化酶试验IMViCKIA、MIU最终鉴定：系统生化反应肠内感染

大肠埃希菌鉴定依据肠道选择培养基上为乳糖发酵菌落KIA上发酵葡萄糖产酸产气、大多数分解乳糖，不产硫化氢IMViC++--，MIU++—致病性大肠埃希菌除生化反应符合外，必须做血清学鉴定或毒力测定

第三节沙门菌属

Salmonella一大群人与动物肠道中的寄生菌菌群菌型甚多，仅少数对人致病与人类有关系的主要有:

伤寒沙门菌(D群)

副伤寒A沙门菌(A群)

副伤寒B沙门菌(B群)

鼠伤寒沙门菌(B群)

猪霍乱沙门菌(C群)沙门菌属肠道沙门菌邦戈沙门菌22

合计2579（2007年)亚种Ⅰ肠道亚种

1531亚种Ⅱ萨拉姆亚种505亚种Ⅲa亚利桑那亚种99亚种Ⅲb双亚利桑那亚种336亚种Ⅳ豪顿亚种73亚种Ⅵ英迪加亚种13致病沙门菌多为肠道亚种一、分类

Kauffmann-White沙门菌血清分型系统二、临床意义：致病因素1.侵袭力菌毛——吸附

Vi抗原——微荚膜（抗吞噬）2.内毒素3.肠毒素个别（鼠伤寒沙门菌）产生与ETEC肠毒素相似致病种类：1.伤寒、副伤寒;

携带者2.非伤寒型沙门菌感染(1)胃肠炎(2)肠外感染;菌血症胆囊-----肠道-------粪排菌皮肤----血栓出血--玫瑰疹肾-----尿肝脾-----肿大骨髓伤寒沙门和副伤寒杆菌小肠肠系膜淋巴结

进入血液再次进入血液第一次菌血症第二次菌血症病程第1周伤寒和副伤寒的致病过程第二次菌血症病程2，3周全身单核吞噬细胞系统

（肝、脾、骨髓与淋巴结中的巨噬细胞吞噬）

+大量生长繁殖小肠巨噬细胞吞噬+繁殖三、微生物学检查（一）生物学性状：1、共性：2、个性：1)、本菌较为细长，周身鞭毛 2)、培养及生化

不发酵乳糖发酵葡萄糖产酸产气（伤寒沙门菌不产气）

多数H2S+，动力+，尿素（-）（副伤寒A不产H2S

）

KIAKA++MIU+--IMViC-+-+（伤寒/猪霍乱沙门菌：CIT(-)）

伤寒沙门菌镀银染色×1000伤寒沙门菌：KIA（KA－＋）MIU（＋－－）IMViC（－＋－－）麦康凯平板：不发酵乳糖形成不透明无色菌落SS（Salmonellashigella）平板：产生H2S,黑色菌落伤寒沙门菌Ｍac37℃18hSS(salmonella-shigella)配方牛肉浸粉：5g蛋白胨：5g乳糖：10g胆盐：8.5g煌绿：0.33mg枸椽酸钠：8.5g硫代硫酸钠：8.5g枸椽酸铁：1.0g中性红：0.025g琼脂：13.5g蒸馏水：1000mlSS培养基（沙门志贺培养基）乳糖、中性红指示剂、胆盐、煌绿等抑制剂选择抑制作用（强选）大肠埃希菌产酸桃红色乳糖发酵菌落伤寒沙门菌无色乳糖不发酵菌落胆盐、煌绿：抑制大肠埃希菌及G+菌，提高肠道致病菌检出率乳糖发酵中性红呈红色乳糖不发酵H2S（+）菌株中心黑色的菌落伤寒沙门菌SS37℃18h

（3)

抗原构造：极为复杂

O抗原耐热、刺激机体产生IgM

共有58种,表示方法：用字母O和阿拉伯数字标记，O1,O2,O3……….O67

如：伤寒杆菌：O9、O12

沙门氏菌的分群及表示方法沙门菌分群的依据:含有共同O抗原的血清型归为一个群大写字母及相关符号表示：A、B、C、D、E、F……Z、O51~O63、O65~O67

沙门氏菌中的主要菌群及其群特异性抗原A群----O2B群----O4C群----O6D群----O9F群----O11

E群----O3

H抗原:

分型的依据

刺激机体产生IgG

鞭毛抗原H：分第1相和第2相第一相：特异相

表示方法：a,b,c……,z,z1,z2,z3……,z65

第二相：非特异相，表示为1，2，3，……，其中也有用小写字母a、n、x等表示仅有一相H抗原的沙门菌称为单相菌同时有第一相和第二相抗原的细菌称双相菌③

表面抗原：Vi抗原（virulence）：热不稳定毒力有关抗原性弱，刺激机体产生短暂低效价抗体伴随活菌一起存在测定Vi抗体有助于检出带菌者

有Vi抗原的菌株不被相应的抗O血清凝集，称为O不凝集性，破坏Vi抗原：60℃30min，100℃5minM抗原5抗原5)、本属细菌易于变异

①S—R变异

②H—O变异

③位相变异（双相菌变为单相菌）

④V—W变异：有Vi抗原的菌株(V型)失去Vi抗原(W型)，即细菌与抗O血清凝集而不再与抗Vi血清凝集，称为V-W变异

）

4)、抵抗力：对胆盐和煌绿有抵抗力三、实验检查：1.标本采集①病程第一周内采集静脉血，因此时患者处于菌血症时期。②第2～3周采集粪便、尿标本，此时细菌由血流经胆汁进入肠腔，部分由粪便排出，而进入肾的细菌则随尿液排出体外。③病程第4周后，为恢复期慢性带菌状态，仍可作粪便培养。④全程可取骨髓做培养。2.直接检查(1)显微镜检查：(2)抗原检测:3.分离培养与鉴定增菌培养基：血标本、骨髓：胆汁葡萄糖肉汤粪标本：革兰阴性增菌肉汤(Gramnegative,GN)常用培养基：血标本——BAP,Mac;

粪标本——Mac+SS琼脂菌落特点：EMB上无色或不透明琥珀色

MAC上较小、无色透明

SS上不透明或透明、无色或中央为黑色的菌落

XLD上呈红色或中央为黑色的菌落最后鉴定：

①全面生化试验②血清学分型鉴定（1）生化鉴定初步鉴定：KIAKA++（伤寒沙门菌发酵葡萄糖不产气）

MIU+--IMViC-+-+

吲哚阴性、动力阳性、VP阴性、枸橼酸盐阴性、鸟氨酸阳性凡临床分离菌乳糖阳性、吲哚阳性或脲酶阳性者均不考虑为沙门菌(2)血清学分型

95%以上的沙门菌临床分离株属A—F群

第一步：A—F群多价诊断血清凝集试验（+）---该菌属于A—F群沙门菌第二步：A，B，C，D，E，F各单价因子血清凝集试验

鉴定血清群（A、B、C、D、E、F群)-----判定其属于沙门氏菌属何群第三步：H因子血清凝集试验鉴定血清型

----判定为何种血清型例:A-F多价O（＋）：单价因子血清凝集:O9（＋）D群

H因子血清凝集:d（＋）

A-F多价O（－），做Vi血清因子凝集：（＋）浓菌液沸水煮沸30min，再用A-F多价O血清定群；（－）继续以A-F以外的多价O血清凝集分型。血清凝集注意：确定O群后，一定要用H因子再做凝集；最终结果要以凝到H相后才能报告全名为肠道沙门菌肠道亚种伤寒血清型(或简称沙门菌伤寒血清型)伤寒沙门氏菌

(9,12:d:-)主要沙门氏菌抗原结构表群菌名O抗原H抗原第一相第二相A甲型副伤寒菌1.212.a_B乙型副伤寒菌1.4.5.12.b1.2鼠伤寒杆菌1.4.5.12.i1.2C希氏伤寒菌6.7.Vic1.5丙型副伤寒菌6.7c1.5D伤寒杆菌9.12.Vid--肠炎杆菌1.9.12g.m--E鸭沙门氏菌3.10.e.h1.6伤寒沙门菌(D群)甲型副伤寒沙门菌(A群)乙型副伤寒沙门菌(B群)鼠伤寒沙门菌(B群)猪霍乱（或丙型副伤寒）沙门菌(C群)③Vi噬菌体分型：非常规项目4、抗体检测：肥达反应（Widaltest）1)原理：已知的伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌O，H标准抗原血清中相应的抗体2)诊断标准：伤寒沙门菌:抗O(IgM)＞1:80,抗H＞1:160,副伤寒沙门菌H抗原:抗O(IgM)＞1:80,抗A，B，C＞1:80动态观察：双份血清抗体四倍升高有诊断意义3)应用：辅助诊断伤寒、副伤寒A，B，C。肥达反应(Widaltest)O凝集（1:20～1:1280，效价1:80）H凝集（1:20～1:1280，效价1:320）生理盐水＋待检血清＋诊断抗原O抗原伤寒H甲型副伤寒H乙型副伤寒H观察结果1:201:401:801:1601:3201:640

伤寒O1：160，伤寒H1：320肥达反应结果分析O抗体（IgM），H抗体（IgG）O、H抗体均升高，患伤寒的可能性大O、H抗体不升高，患伤寒的可能性小只有H升高，则可能是预防接种过或非特异性回忆反应只有O升高而H不高，则可能是感染早期或其他沙门菌的交叉反应沙门菌检验程序

、

血清学定群、定型终报：分离出伤寒沙门菌沙门菌鉴定依据沙门菌鉴定主要依靠生化反应和血清学鉴定肠道选择平板上无色半透明菌落KIA：KA++MIU：+--

IMViC-+-+与A-F多价O诊断血清和相应O因子血清、H因子血清凝集注意Vi抗原的存在第四节志贺菌属（Shigella）一、抗原与分类根据O抗原分类：分为四个血清群菌种群型亚型痢疾志贺菌A1~10福氏志贺菌B1~6，X，Y变种鲍氏志贺菌C1~15宋内志贺菌D1

二、临床意义：致病物质1、侵袭力：菌毛—有利于菌粘附至肠粘膜2、毒素：内毒素肠粘膜通透性升高→毒素吸收→发热、神志障碍、休克破坏肠粘膜→炎症、溃疡、脓血粘液便肠壁植物神经→肠蠕动失调、痉挛→腹痛、里急后重内毒素血症外毒素（A群Ⅰ、Ⅱ型）志贺毒素ST(VT)有3种毒性，与内毒素协同作用，加重局部和全身症状局部（肠壁）全身所致疾病1、急性细菌性痢疾急性典型、急性非典型、急性中毒性菌痢2、慢性细菌性痢疾3、携带者

感染灶局限于结肠粘膜层，一般不入血四、微生物学检验（一）生物学性状：1、共性（略）2、个性：1)有菌毛，无鞭毛，无动力（与其它肠道致病菌主要区别点）2)能分解葡萄糖，产酸不产气，不分解乳糖3)无H抗原4)在麦康凯平板上形成无色中等大小菌落（乳糖不发酵菌落）

宋内志贺菌常形成粗糙型菌落

5)抵抗力较其它肠杆菌科细菌为低,对酸敏感（革兰染色）宋内志贺菌大肠埃希杆菌:粉红色，乳糖发酵菌落福氏痢疾杆菌:菌落小，无色透明，非乳糖发酵菌(MAC,18hr,37℃)SSAgar(SalmonellaShigellaAgar)志贺菌KIA（KA－－）MIU（－－－）志贺菌IMViC试验（－＋－－）（二）实验检查1.标本采集发病早期（治疗前）采集粘液脓血便肛拭子

床边接种或立即送检2.分离培养：选择麦康凯和SS琼脂分离培养

菌落：麦康凯:乳糖不发酵无色半透明的菌落SS琼脂:无色菌落3.鉴定：①

初步鉴定：

KIAK

A－－

MIU－－/+－

IMViC－/++－-②

最终鉴定全面生化反应+血清学鉴定

血清学分型与生化反应不一致者均为非志贺菌③血清学鉴定：第一步：该属4群细菌的多价诊断血清做玻片凝集试验（A群1，2型，B群1—6型，C群1—6型，D群）第二步：定型诊断血清进行分型：

A群：痢疾志贺菌：共10个血清型O1~O10B群：福氏志贺菌：共6个血清型和X，Y2变型

C群：鲍特志贺菌：共15个血清型

D群：仅一个血清型

4毒力试验：豚鼠眼结膜试验志贺菌检验程序

将待检标本接种肠道选择平板，35℃培养18～24小时若标本含菌量少，可先增菌（GN增菌液）4～6小时再分离培养挑取无色半透明菌落，进行初步生化反应鉴定符合志贺菌生化反应特征可进行血清学鉴定血清学鉴定先用志贺氏多价诊断血清作玻片凝集试验，若凝集再用A、B、C、D群诊断血清鉴定到种、型血清学鉴定需注意K抗原的阻断作用，并应考虑是否为EIEC终报：分离出福氏志贺菌2a型志贺菌鉴定依据肠道选择平板上无色半透明菌落KIA：KA--MIU