生物化学实验一

中国药科大学生化实验一

吴旭日

实验五核酸的提取与鉴定实验三酪蛋白含量测定实验二凝胶层析分离纯化酪蛋白实验一酪蛋白的粗提取实验六谷丙转氨酶活性的测定实验四SDS测定酪蛋白MW一.实验安排实验七蔗糖酶米氏常数的测定实验八设计性实验报告实验要求准时进行实验，不得迟到、早退。实验前5分钟核对实验用品并登记补齐。课代表实验前10分钟打开柜门、电阀。了解实验安全设施（水冲洗，灭火器）。穿实验服，安静，不做无关事。按学号两人一组，对面两组同学共用一套试剂，不得取用别组试剂。实验结束后上交实验数据，核对实验用品，整理台面。课代表安排4-6名值日生，试剂归位，打扫卫生，关电阀和门窗。实验报告的格式：题目、摘要、实验目的、实验原理、实验结果、分析讨论与习题。报告以英文书写为主。做好实验预习二.酪蛋白的粗提取原理蛋白质维持水溶液的胶体状态的因素：-NH3+;-COO-;-OH;-SH;-SO3H;磷酸基团，葡萄糖等水化层同种电荷蛋白质沉淀25341盐析法有机溶剂沉淀法重金属盐沉淀法加热凝固法生物碱试剂以及某些酸类沉淀法蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀(precipitation)。蛋白质沉淀-沉淀方法

①

盐析(saltingout)不变性可逆低盐浓度盐溶同种电荷排斥高盐浓度盐析破坏水化层，中和电荷(NH4)2SO4、NaCl、Na2SO4②有机溶剂有时变性等电点更易沉淀失去水化层空间结构破坏有机溶剂蛋白质柔性降低变性原因：空间结构破坏、柔性降低分辨能力比盐析法高，即蛋白质或其它溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；沉淀不用脱盐，过滤较为容易；在生化制备中应用比盐析法广泛。但是在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此。因此，操作要求在低温下进行。③重金属盐沉淀

pH>pI时带负电荷

与Cu2+、Ag+

、Hg2+

、Pb2+沉淀蛋白解毒：临床上利用这种方法，抢救误服重金属盐中毒的病人，给病人口服大量蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。

生物碱（alkaloid）是存在于自然界（主要为植物，但有的也存在于动物）中的一类含氮的碱性有机化合物，但是蛋白质、肽类、氨基酸和Vb除外。④生物碱试剂沉淀吡啶类：如苦参碱莨菪烷类：如莨菪碱异喹啉类：如罂粟碱、汉防己甲素、小檗碱、吲哚类：如吴茱萸碱、长春碱、长春新碱萜类：如乌头碱、紫杉醇甾体：如贝母碱有机胺类：如麻黄碱、伪麻黄碱

能沉淀生物碱的化学试剂叫做生物碱试剂。如：单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸。

pH<pI时带正电荷当蛋白质溶液pH值低于其等电点时，蛋白质为阳离子，能与生物碱试剂的阴离子结合成性盐而沉淀。蛋白质与苦味酸、磷钨酸、磷钼酸、鞣酸、三氯醋酸、磺基水杨酸沉淀临床应用：血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可用于检验尿中蛋白质(150mg/24h)。⑤加热变性等电点易沉淀偏酸、偏碱变性但不易沉淀加热首先是加热使蛋白质变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋清都凝固。蛋白质沉淀-与变性的关系变性的蛋白质不一定沉淀如煮沸的纯牛奶，其中的酪蛋白已经变性，但并不沉淀。变性的蛋白更容易消化。沉淀的蛋白质不一定变性如盐析、低温下有机溶剂沉淀的蛋白质。凝固的蛋白质既沉淀又变性如酸牛奶pH已接近有关蛋白质的pI，一旦煮沸便开始变性，蛋白质即结絮沉降下来。蛋白质沉淀-酪蛋白(casein)提取牛奶中87%是水，13%是乳固体。而在乳固体中27%是乳蛋白质，乳蛋白质中含80%是酪蛋白和20%的乳清蛋白。

酪蛋白沉淀后剩余的蛋白质统称乳清蛋白。乳清蛋白不同于酪蛋白，其粒子的水合能力强、分散性高，在奶中呈高分子状态。酪蛋白特性①来源酪蛋白（casein）又称干酪素、酪素、酪朊，乳酪素。通常是指由牛乳腺分泌的多种(约20种)磷蛋白(phosphoproteins)的混合物。②电泳分类α-酪蛋白(75％)：23.6kDa，三种变异型β-酪蛋白(22％)：24.0kDa，七种变异型к-酪蛋白：19.0-20.0kDa，两种变异型γ-酪蛋白:β-酪蛋白降解产物19.0kDa左右③密度1.25～1.31

g/cm3

④性状纯酪蛋白为白色至浅黄色颗粒或粉状，无臭无味。

⑤溶解情况微溶于水及有机溶剂，溶于碱性溶液及浓酸。⑥用途食品增稠剂，营养强化剂、乳化剂和稳定剂。用于冰淇淋、饼干、面包、花味油膏、蛋黄酱、火腿、腊肠等。还用作木材胶料、纸张涂料、糖尿病人食品、生物用料、纺织浆料、水溶性涂料的基料、塑料钮扣的原料、粘合剂原料、医药及生化试剂等。蛋白质沉淀-离心机的原理利用离心力，分离液体与固体颗粒或液体与液体的混合物中各组分的机械。

离心机可将悬浮液中的固体颗粒与液体分开；或将乳浊液中密度不同，互不相溶的液体分开(例如从牛奶中分离出奶油)；也可用于排除湿固体中的液体，例如用洗衣机甩干湿衣服；超速管式分离机可分离不同密度的气体混合物；有的离心机还可对固体颗粒按进行密度分级。①s=v/ω2r

每单位引力场生物大分子下沉的速度称为沉降系数.s（sedimentationcoefficient）是沉降系数，ω是离心转子的角速度（弧度/秒），r是到旋转中心的距离，v是沉降速度。决定于生物大分子的分子量、密度和形状。②RCF=1.119×10-5×(rpm)2×rRCF表示相对离心场，以重力加速度g的倍数来表示；rpm(或r/min)表示离心机每分钟的转数。r表示离心机转轴中心与离心管中心的距离，单位为cm。实验步骤10ml纯牛奶加等体积饱和硫酸铵溶液（边加边搅拌）静置5min分装入2支离心管3000转离心15-20min弃去下层清液每管加95%乙醇溶液至10ml（打散）3000转离心5-10min取沉淀加95%乙醇溶液至10ml（打散）3000转离心5-10min取沉淀每管加无水乙醇溶液至5ml（2管并为1管）3000转离心10min弃上清保鲜膜封口膜上扎5~10个小孔真空干燥器中干燥冰箱冷藏保存注意事项1.离心前，须平衡离心管（与离心套管一起平衡）。2.上清、沉淀的取舍（取乳白色部分）。3.保存好样品，留作下次实验之用。EXPERIMENT1.ExtractionandCharacteristicsDeterminationofCaseinSection1CrudeExtractionofCasein实验报告格式

Abstract:

Purpose:Studytheextractionmethodofprotein.(2)Mastertheusageprincipleofcentrifuge.Method:saltingoutResult:Wecangetcrudeextractionofcaseinfrompuremilkbysaltingout.Keywords:protein,crudeextraction,casein,centrifuge,hydrophilic,hydrationshell,precipitation,aggregation,puremilk,ethanol,ether,equilibrate,saltingout,ammoniumsulfate,ionicstrengthPrincipleThesolubilityofproteinisdeterminedby：①thedegreeofhydrationshell,②thechargestateoftheprotein.Whenneutralsaltisaddedintoproteinsolution,thehydrationshellwillbeweakenedandeveneliminated,andthechargesontheproteinmolecularsurfacewillbe

neutralized.2.Attentions3.ResultsandDiscussions(1)Mustequilibratethecentrifugetubesbeforecentrifugalization.(2)Makeyourchoiceofsupernatantorprecipitationaftercentrifugalization.4.Answerstoquestions报告评分标准：平时成绩60%A+：，A：，A-：，

B：，C：考核成绩30%预习及回答问题10%TwoStepProcessforDiketo-reductionCatalyzedbyDiketoreductaseAbstract：

Aim:Toinvestigatethe

diketoreductionprocesscatalyzedbydiketoreductase.Methods:Separationofthetwomono-hydroxyintermediateswereconductedonaC-18columnchromatographyandsubsequentlyconfirmedbychiralHPLC.Results:Twomono-hydroxyintermediateswereproducedduringthediketonere