微生物的分类鉴定

关于微生物的分类鉴定第1页，共59页，2023年，2月20日，星期四地球上开始出现生命，主要是些类似简单杆状细菌的原始生物。大约46亿年前，地球形成；大约35亿年前，通过“前生命的化学进化”过程漫长的进化历程千姿百态的生物种类第2页，共59页，2023年，2月20日，星期四形成于35亿年前的微生物化石主要是些类似简单杆状细菌的原始生物形成于8.5亿年前的微生物化石20亿年前以后的岩石中的微生物的化石形态多样性明显增多第3页，共59页，2023年，2月20日，星期四形成于10亿年前的微生物化石形态上非常类似于现代的蓝细菌，进行不产氧光合作用的光能自养菌，及化能无机营养的硫细菌。形态上类似于现代的绿藻（真核生物）第4页，共59页，2023年，2月20日，星期四第5页，共59页，2023年，2月20日，星期四微生物分类学的基本任务：

对已知的大量的提炼出分类单元1、分类2、鉴定3、命名给新发现物种命名（一般用拉丁语）对未知的个别的进行鉴定，归入分类系统第6页，共59页，2023年，2月20日，星期四一分类单元界（Kingdom）门（Phylum或Division）

纲（Class）

目（Order）

科（Family）

属（Genus）

种（Species）

第一节通用分类单元

第7页，共59页，2023年，2月20日，星期四二种的概念

动物的种：凡两个能互相交配产生具有有性生殖能力的物种。微生物的种：是最基本的分类单元，它是表型特征高度相似，亲缘关系极其相近，与同属内的其它种有着明显差异的菌株的总称。

菌株（Strain）：任何由一个独立分离的单细胞繁殖而成的纯种的种群（纯培养物）及其一切后代。

模式菌株（种）：是被指定的代表一个种的菌株，该菌株具有此种的各个典型形状，即具体的种。

第8页，共59页，2023年，2月20日，星期四BacillussubtilisASI.398BacillussubtilisBF7658生产蛋白酶生产α淀粉酶第9页，共59页，2023年，2月20日，星期四第10页，共59页，2023年，2月20日，星期四三学名

属名：在前，一般用拉丁文名词表示，字首字母大写，表示形态、构造等主要特征。

种名：在后，常用拉丁文形容词表示，全部小写，表示来源、寄主、颜色等次要特征。若所分离的菌株只鉴定到属，而未鉴定到种，可用sp来表示，例如Bacillussp.（spp.）1、双名法

学名＝属名＋种加词＋（首次定名人）＋现定名人＋定名年份

斜体正体（一般省略）

第11页，共59页，2023年，2月20日，星期四2、三名法

命名一亚种或变种时用三名法。

学名＝属名＋种加词＋符号Subsp或Var＋亚种或变种的加词

斜体正体（可省）斜体

亚种（subspecies，subsp，ssp.）：进细一步的分类单元，一般指除某一明显而稳定的特征外，其余鉴定特征与模式种相同的种。

变种（Variety，Var）：亚种的同义词，现已不用。型（Form）：菌株的同义词，现已废除。第12页，共59页，2023年，2月20日，星期四四微生物在生物界中的分类地位1、界级分类1753年，二界：动物界、植物界*；1860年，三界：动物界、植物界、原始生物界*；

1956年，四界：动物界、植物界、原始生物界*（原生动物、真菌、藻类）、菌界*（细菌、蓝细菌）；第13页，共59页，2023年，2月20日，星期四1949年，六界：后生动物界、后生植物界、原生生物界*、真菌界*、原核生物界*、病毒界*；

1977年，王大耜

六界：在五界基础上加一病毒界*；1996年，六界：动物界、植物界、原生生物界*、真菌界*、真细菌界*、古细菌界*。1969年，五界：动物界、植物界、原生生物界*、真菌界*、原核生物界*；第14页，共59页，2023年，2月20日，星期四2、三域学说（三原界系统）细菌域（真细菌原界）、古细菌域（古细菌原界）、真核生物域（真核生物原界）古细菌特点：1）细胞壁缺乏常规肽聚糖成分；2）细胞壁类脂成份特殊；3）16srRNA核苷酸序列特殊；4）tRNA成份特殊，无T；5）Pr合成的起始密码特殊：甲硫氨酸（与真核生物同）；6）生态条件特殊。

第15页，共59页，2023年，2月20日，星期四五各大微生物的分类系统1、细菌细菌、放线菌等原核微生物的分类系统很多，目前较有代表性和最有影响的分类系统是美国的《伯杰氏细菌学鉴定手册》(Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology

，简称“手册”)1923年第一版以来，相继于1925、1930、1934、1939、1948、1957、1974和1994年出版了第二版至第九版第16页，共59页，2023年，2月20日，星期四2000年，Bergey’sManualofSystematicBacteriology第二版编辑完成并分成5卷陆续出版。在此第二版中，细菌域分为16门，26组，27纲，62目，163科，814属，收集了4727个种。古菌域分为2门，5组，8纲，11目，17科，63属，收集了208个种。供收集进原核微生物4935个种。在1984～1989年间，“手册”的出版者出版了《伯杰氏系统细菌学手册》(Bergey’sManualofSystematicBacteriology

，简称“系统分类学手册”)与“手册”有很大不同：首先是在各级分类单元中广泛采用细胞化学分析、数值分类方法和核酸技术，尤其是16SrRNA寡核苷酸序列分析技术，以阐明细菌的亲缘关系，并对第八版手册的分类作了必要的调整。第17页，共59页，2023年，2月20日，星期四2、菌物（真菌）

1995年，《安·贝氏菌物词典》，第八版。第18页，共59页，2023年，2月20日，星期四第二节微生物的分类鉴定一经典指标1、个体细胞形态、大小、排列方式，染色反应，有无运动，各种特殊构造特征等2、形态特征菌落形态，在固体、半固体或液体培养基中的生长状态等第19页，共59页，2023年，2月20日，星期四3、营养要求碳源、氮源、矿质元素、生长因子等4、生理生化特征代谢产物种类、产量、显色反应等产酶种类和反应特征等5、酶第20页，共59页，2023年，2月20日，星期四生理生化特征在以实用为主要目的表型分类中，生理生化特征往往是细菌分类鉴定的主要特征。肠道菌科细菌属和种的分类鉴定就是如此。能否发酵乳糖能否以柠檬酸为唯一碳源产生赖氨酸、脱羧酶志贺氏菌属产生硫化氢沙门氏菌属是否产生3-羟基丁酮柠檬酸杆菌属埃希氏杆菌属肠杆菌属第21页，共59页，2023年，2月20日，星期四6、生态学特性生长温度，对氧的需要，酸碱度要求，宿主种类，生态分布等7、血清学反应8、噬菌体的敏感性第22页，共59页，2023年，2月20日，星期四形态和生理生化特征是最常用的细菌分类、鉴定指标第23页，共59页，2023年，2月20日，星期四在现代微生物分类中，任何能稳定地反映微生物种类特征的资料，都有分类学意义，都可以作为分类鉴定的依据。形态学特征、生理学特征、生态学特征从不同层次(细胞的、分子的)，用不同学科(化学、物理学、遗传学、免疫学、分子生物学等)的技术方法来研究和比较不同微生物的细胞、细胞组分或代谢产物，从中发现的反映微生物类群特征的资料。生物分类的传统指标：第24页，共59页，2023年，2月20日，星期四二现代指标

（一）遗传学指标1、DNA中G+Cmol%分析1）每个生物种都有特定的G+C%范围，因此可以作为分类鉴定的指标。细菌的GC%范围为

25--75%，变化范围最大，因此更适合于细菌的分类鉴定。第25页，共59页，2023年，2月20日，星期四第26页，共59页，2023年，2月20日，星期四2）GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌作出鉴定，并可检验表型特征分类的合理性，从分子水平上判断物种的亲缘关系。3）使用原则：G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定每一种生物都有一定的碱基组成，亲缘关系近的生物，它们应该具有相似的G+C含量，若不同生物之间G+C含量差别大表明它们关系远。但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它们之间具有近的亲缘关系。第27页，共59页，2023年，2月20日，星期四同一个种内的不同菌株G+C含量差别应在4～5%以下；同属不同种的差别应低于10～15%；若二个在形态及生理生化特性方面极其相似的菌株，如果其G+C含量的差别大于5%，则肯定不是同一个种，大于15%则肯定不是同一个属。第28页，共59页，2023年，2月20日，星期四①

80年代以前螺菌属(Spirillum)不同种的G+C含量范围宽达38～66%，后来“伯杰氏手册”(1984)结合其他特征已将其分成三个属：螺菌属、海洋螺菌属(Oceanospirillum)和水螺菌属(Aquaspirillum)

它们G+C含量分别为38%、42～51%和49～66%；②过去根据形态学特征曾认为微球菌属(Micrococcus)和葡萄球菌属(Staphylococcus)是关系很近的两个属，因而长期放在一个科内，由于G+C含量的差异(分别为30～38%和64～75%)表明它们亲缘关系相当远，现在根据16SrRNA序列资料已进行新的调整。第29页，共59页，2023年，2月20日，星期四在疑难菌株鉴定、新种命名、建立一个新的分类单位时，G+C含量是一项重要的，必不可少的鉴定指标。其分类学意义主要是作为建立新分类单元的一项基本特征和把那些G+C含量差别大的种类排除出某一分类单元。G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定第30页，共59页，2023年，2月20日，星期四2、核酸的分子杂交不同生物DNA碱基排列顺序的异同直接反映生物之间亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间的亲缘关系就越近，反之亦然。

直接分析比较DNA的碱基排列顺序------由于技术上的困难目前尚难以普遍地进行；

核酸分子杂交(hybridization)间接比较不同微生物DNA

碱基排列顺序的相似性第31页，共59页，2023年，2月20日，星期四1）DNA-DNA杂交；（亲缘关系相对近的微生物之间的亲缘关系比较）2）DNA-rRNA杂交；（亲缘关系相对远的微生物之间的亲缘关系比较）3）核酸探针；（利用特异性的探针，用于细菌等的快速鉴定）第32页，共59页，2023年，2月20日，星期四第33页，共59页，2023年，2月20日，星期四第34页，共59页，2023年，2月20日，星期四特异性的探针主要用于病原微生物的快速鉴定第35页，共59页，2023年，2月20日，星期四3、电子杂交随着微生物基因信息，特别是全基因组完全测序的不断增加，我们可以通过各种计算机软件对不同物种的遗传信息进行直接比较，从而分析不同微生物间的亲缘关系。第36页，共59页，2023年，2月20日，星期四蛋白质、RNA和DNA序列进化变化的显著特点是进化速率相对恒定，也就是说，分子序列进化的改变量(氨基酸或核苷酸替换数或替换百分率)与分子进化的时间成正比。4、16SrRNA编目分析

a）在两群生物中，如果同一种分子的序列差异很大时，------------进化距离远，进化过程中很早就分支了。b）如果两群生物同一来源的大分子的序列基本相同，------------处在同一进化水平上。第37页，共59页，2023年，2月20日，星期四16SrRNA被普遍公认为是一把好的谱系分析的“分子尺”：1）rRNA具有重要且恒定的生理功能；2）在16SrRNA分子中，有高度保守、中度保守和高度变化序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究；3）16SrRNA分子量大小适中，便于序列分析；4）rRNA在细胞中含量大(约占细胞中RNA的90%)，也易于提取；5）16SrRNA普遍存在于真核生物(同源分子是18SrRNA)和原核生物中。因此它可以作为测量各类生物进化的工具。4、16SrRNA编目分析

第38页，共59页，2023年，2月20日，星期四核糖体RNA第39页，共59页，2023年，2月20日，星期四第40页，共59页，2023年，2月20日，星期四利用16SrRNA建立分子进化树的美国科学家

CarlWoese

第41页，共59页，2023年，2月20日，星期四rRNA和系统发育树1.rRNA的顺序和进化培养微生物提取并纯化rRNArRNA序列测定分析比较微生物之间的系统发育关系（从cDNA序列得出）第42页，共59页，2023年，2月20日，星期四用反转录酶和双脱氧测序法对微生

物培养物进行测序的步骤用PCR法进行rRNA测序第43页，共59页，2023年，2月20日，星期四a代表16SrRNA的全长c系统发育树b进化距离，即任意两个生物RNAs间非同源序列的比例第44页，共59页，2023年，2月20日，星期四2.特征序列或序列印记（signaturesequence）通过对rRNA全序列资料的分析比较（特别是采用计算机）发现的在不同种群水平上的特异特征性寡核苷酸序列，或在某些特定的序列位点上出现的单碱基印记。特征序列有助于迅速确定某种微生物的分类归属，或建立新的分类单位。第45页，共59页，2023年，2月20日，星期四定义3种生物领域的16S或18SrRNA的序列特征第46页，共59页，2023年，2月20日，星期四3.系统发育树(phylogenetictree)通过比较生物大分子序列差异的数值构建的系统树称为分子系统树，其特点是用一种树状分枝的图型来概括各种(类)生物之间的亲缘关系。图型中，分枝的末端和分枝的连结点称为结(node)，代表生物类群，分枝末端的结代表仍生存的种类。系统树可能有时间比例，或者用两个结之间的分枝长度变化来表示分子序列的差异数值。第47页，共59页，2023年，2月20日，星期四16SrRNA系统发育树第48页，共59页，2023年，2月20日，星期四16SrRNA系统发育树第49页，共59页，2023年，2月20日，星期四系统发育树第50页，共59页，2023年，2月