细胞培养基本技术专家讲座

细胞培养基本技术BinLu,Ph.D.

细胞培养基本技术第1页/ThomasC.SüdhofRandyW.SchekmanJamesE.RothmanBorn:

3November1950,Haverhill,MA,USABorn:

30December1948,St.Paul,MN,USABorn:

22December1955,Goettingen,GermanyStanfordUniversity,Stanford,CA,USA

UniversityofCalifornia,Berkeley,CA,USAYaleUniversity,NewHaven,CT,USA细胞培养基本技术第2页Prizemotivation:

"fortheirdiscoveriesofmachineryregulatingvesicletraffic,amajortransportsysteminourcells"细胞培养基本技术第3页1665年英国学者RobertHooke，用自制显微镜观察软木薄片，第一次发觉植物细胞结构，并首次借用拉丁文Cella（小室）词.1983-39德国植物学家施莱登和动物学家施旺确立了“细胞学说”基本标准。（１）细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来；（２）每个细胞都作为一个相正确独立单位，有自己“生命”。（３）新细胞能够经过老细胞繁殖产生。进化论，遗传学和细胞学说定为当代生物学三大基石，而细胞学说又是前二者"基石"。细胞培养基本技术第4页Thecellisthebasicstructuralandfunctionalunitofallknownlivingorganisms.Itisthesmallestunitoflifethatisclassifiedasalivingthing,andisoftencalledthebuildingblockoflife.Organismscanbeclassifiedasunicellular(consistingofasinglecell;includingmostbacteria)ormulticellular(includingplantsandanimals).Humanscontainabout10trillion(10)cells.Mostplantandanimalcellsarebetween1and100µmandthereforearevisibleonlyunderthemicroscope.13细胞培养基本技术第5页

主要内容一、细胞培养基本概念二、细胞培养基本条件三、细胞培养用液配制四、细胞培养基本方法五、培养细胞活力测定六、细胞冻存和复苏七、细胞培养污染和检测细胞培养基本技术第6页是指从体内取出组织，分离细胞；或使用细胞系，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功效特征。一、细胞培养基本概念细胞培养(cellculture)：把活体一小片组织（O.5～1立方毫米）置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长。组织培养(Tissueculture)：器官培养(Organculture)：将活体中整个器官或一部分器官取出，置于生长并同时保持其一定结构和功效特征。细胞培养基本技术第7页细胞培养基本概念原代培养取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长细胞在传代之前称为原代培养。优点组织细胞刚脱离机体，生物性状还未发生较大改变，在一定程度上能够反应体内状态。细胞培养基本技术第8页传代原代培养细胞或细胞系，在生长、繁殖一定时间后，因为空间不足或细胞密度过大，造成营养枯竭，会影响细胞生长，所以需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新培养器皿中。细胞培养基本技术第9页

SurfaceArea(mm2)SeedingDensityCellsatConfluency1Versene(mlof0.05%EDTA)Trypsin(mlof0.05%tryspin,EDTA)GrowthMedium(ml)Dishes35mm9620.3x1061.2x10611260mm2,8270.8x1063.2x106323100mm7,8542.2x1068.8x1065310150mm17,6715.0x10620.0x10610820CulturePlates6-well9620.3x1061.2x106223-512-well4010.1x1060.4x106111-224-well2000.05x1060.2x10-1.0FlasksT-252,5000.7x1062.8x106333-5T-757,5002.1x1068.4x106558-15T-16016,0004.6x10618.4x106101015-30UsefulNumbersforCellCultureTherearevarioussizesofdishesandflasksusedforcellculture.Someusefulnumberssuchassurfaceareaandvolumesofdissociationsolutionsaregivenbelowforvarioussizeculturevessels.

1Thenumberofcellsonaconfluentplate,dish,orflaskwillvarywithcelltype.

Forthistable,HeLacellswereused.细胞培养基本技术第10页MammalianCellsplatingCorningtech(800)492-1110X22696wellplate 2.6x105cells/well24wellplate 5.4x104cell/well100mmdish 1.5x106cells/dish150mmdish 4.5x106cells/dish150cm2flask 8x106cells=80-90%confluent细胞培养基本技术第11页传代注意事项

接种数量为5×10～8×10个/ml。传代密度太低，细胞轻易死亡，表现出细胞在达到增加前有较长滞留期。培养液因为pH下降而展现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。假如是单层贴壁细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。45细胞培养基本技术第12页原代培养细胞生命归宿1.原代培养期2.传代期3.衰退期细胞培养基本技术第13页细胞培养基本技术第14页细胞系（cellline）：传代培养细胞是细胞系(原代培养物经首次传代成功后即成细胞系)。有限细胞系（finitecellline)，无限细胞系(infinitecellline)

细胞系（cellline）肿瘤细胞系多由瘤建成，多呈类上皮型细胞，含有不死性和异体接种致瘤性。细胞培养基本技术第15页细胞株（cellstrain）由含有一些特征与标志细胞，经选择或克隆化而派生亚系，这些特征或标志在后续培养中一直保持下去细胞群。

再由原细胞株深入分离培养出与原株性状不同细胞群，亦可称之为亚株。细胞培养基本技术第16页细胞系或细胞株命名

以供体患者姓名命名：

HeLa（起源于宫颈癌）

以时间地点来命名：

CHO中国仓鼠卵巢细胞（ChineseHamsterOvary）宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立

NIH3T3：美国国立卫生研究院（NationalInstituteofHealth）建立，每3天传代，每次接种3×105细胞／ml以组织起源命名：如BHK(幼地鼠肾细胞)

以临床疾病类型命名：如BALL-1细胞系(来自B淋巴细胞急性白血病人白细胞)细胞培养基本技术第17页二、细胞培养基本条件无菌条件细胞生长条件细胞检测条件细胞保留条件试验室安全细胞培养基本技术第18页细胞培养无菌环境

无菌室结构：普通由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。（使用前）紫外照射（15-30分钟）每七天甲醛熏蒸（2小时）和每个月新洁尔灭擦拭地面一次方式进行消毒细胞培养基本技术第19页细胞培养基本技术第20页超净工作台

超净工作台工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气渐渐经过工作台面，使工作台内组成无菌环境。细胞培养基本技术第21页超净工作台使用使用前开启柜内紫外灯照射10－30分钟；预工作10－15分钟，以除去臭氧和使工作台面、空间呈净化状态。使用完成后要用70%酒精将台面和台内四面擦拭洁净。

细胞培养基本技术第22页火焰消毒在无菌环境进行培养时，首先关键点燃酒精灯。以后一切操作，如打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。培养瓶滴管、试管、吸管细胞培养基本技术第23页惯用培养器皿清洗及消毒

玻璃器皿清洗

普通经过浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、和清洗（流水冲洗和蒸溜水冲洗）四个步骤，然后50℃烘干。

新橡胶制品洗涤方法

0.5MNaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5MHCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用。

细胞培养基本技术第24页*清洁液配制细胞培养基本技术第25页

消毒压力蒸汽消毒器：湿热消毒，15磅，维持20-30分钟。

消毒前惯用包装材料：牛皮纸、棉布、铝饭盒电热干燥箱：干热消毒，160℃～180℃，维持2小时。主要用于玻璃器皿消毒。

细胞培养基本技术第26页细胞培养试验用具

细胞培养瓶

(Flask)25平方厘米（T25)75平方厘米(T75)150平方厘米(T150)细胞培养基本技术第27页细胞培养板(Plate)

6孔12孔24孔48孔96孔

细胞培养基本技术第28页细胞培养皿(Dish)

35mm60mm

100mm150mm细胞培养基本技术第29页冻存管CryoVial

1.2ml2ml5ml细胞培养基本技术第30页离心管

15ml

50ml细胞刮细胞培养基本技术第31页滤器大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采取滤过法除菌。安装滤膜时注意：滤膜光滑一面是正面，要朝上，不然起不到过滤作用。细胞培养基本技术第32页细胞培养基本技术第33页

CO2培养箱CO2培养箱设定条件为37℃，5％CO2

。使用CO2培养箱培养细胞时应注意问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以确保通气。②保持培养箱内空气洁净。定时消毒。③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。细胞培养基本技术第34页培养细胞观察细胞培养基本技术第35页液氮罐细胞培养基本技术第36页细胞培养基本技术第37页何处购置细胞ATCC细胞库().

美国菌种保藏中心又称美国模式菌种搜集中心。当前它能够提供以下物品

细胞系3000种细菌和噬菌体15000种动植物病毒2500种原生动物1200种以及重组物品欧洲动物细胞库(ECACC)和日本细胞库(RCB)

细胞培养基本技术第38页国内细胞库中国科学院细胞库

中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心中国经典培养物保藏中心也称武汉大学保藏中心，是国家知识产权局指定专利培养物/生物材料／菌种保藏机构。

/cctcc/fzlbc/pywml.htm细胞培养基本技术第39页培养细胞生长条件1

细胞营养需要2细胞生存环境温度:37℃

O2

CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-

pH:7.2-7.4

渗透压

3无污染

4无毒细胞培养基本技术第40页细胞营养碳水化合物、氨基酸和脂类三大类也需要一定量无机盐、维生素和微量元素细胞培养基本技术第41页细胞培养惯用液体

水平衡盐溶液pH调整液消化液抗生素溶液培养基细胞培养基本技术第42页三、细胞培养用液配制水：新鲜三蒸水或去离子水平衡盐溶液主要由无机盐和葡萄糖配制而成作用：维持渗透压、缓冲和调整酸碱度惯用缓冲液：生理盐水

PBS

Hanks液

（D-Hank’s惯用于配制胰酶溶液）细胞培养基本技术第43页平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+缓冲液

PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20

加水至1000ml

D-Hank’s液细胞培养基本技术第44页pH调整液碳酸氢钠液HEPES缓冲液是一个氢离子缓冲剂，能在细胞培养过程中较长时间保持恒定pH范围。通常使用浓度为10～15mM，普通培养液内含20mmol/LHEPES即可到达缓冲能力。细胞培养基本技术第45页消化液胰蛋白酶溶液EDTA溶液胶原酶溶液细胞培养基本技术第46页胰蛋白酶溶液主要作用：

水解与赖氨酸或精氨酸相连接肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞分离。惯用浓度：0.25%

用无Ca2+、Mg2+PBS缓冲液或D-Hank’s配制，用滤器过滤除菌。消化时间：2-10分钟（显微镜下观察）

用含血清培养液终止其对细胞消化作用。

细胞培养基本技术第47页EDTA溶液作用机制：

经过结合（螯合）细胞间质中二价阳离子，从而破坏细胞间连接。使用浓度：

0.02%，配制时应加碱助溶。

EDTA不能被血清中和，终止消化后，需用培养液或PBS彻底冲洗培养瓶。细胞培养基本技术第48页胶原酶溶液主要作用

水解结缔组织中胶原蛋白成份，而对上皮细胞影响不大。惯用剂量：

最终浓度200U/ml（约为1mg/mL）或0.03%~0.3%，可用

D-hanks、PBS或含血清培养液配制。分型：

分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶，依据所要分离消化组织类型选择胶原酶类型（价格贵）。

细胞培养基本技术第49页

胰蛋白酶和胶原酶生物活性差异项目胰蛋白酶胶原酶消化特征消化软组织消化纤维多组织用量0.01%~0.5%0.1~0.3mg/mL（200U/mL）消化时间0.5~2h1~12hpH8~96.5~7.0作用强度强烈缓解细胞影响时间过长有影响无大影响血清抑活有无Ca2+和Mg2+有影响无影响细胞培养基本技术第50页抗生素溶液通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。配制

详细操作均在超净台内完成。青霉素是80万U/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万U/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万U。

使用时溶入培养液中，使青、链霉素浓度最终为100U/ml。庆大霉素：使用终浓度为100U/ml，广谱、稳定。细胞培养基本技术第51页培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成份丰富，培养效果好缺点：起源受限。成份复杂，影响对一些试验产物提取和试验结果分析。易发生支原体污染

细胞培养基本技术第52页合成培养基

依据细胞生存所需物质种类和数量，用人工方法模拟合成。包含四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物当前惯用培养基：RPMI-1640、DMEM、TC199、M199、MEM另有没有血清培养基、无蛋白培养基人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量天然培养基（如血清）。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低缺点：缺乏一些成份，不能完全满足体外细胞生长需要。

细胞培养基本技术第53页RPMI1640最初是由G.E，Moore为培养小鼠白血病细胞而设计。开始配方尤其适合于悬浮细胞生长，主要针对淋巴细胞，后经过改良，从RPMI1630、RPMI1634、直至RPMI1640。其组分较为简单，适合许各种细胞，如肿瘤细胞、正常细胞、原代培养、传代培养等。尤其适合人白细胞，如H9、T-15、HL-60、IM-9和K-562等细胞系培养。细胞培养基本技术第54页RPMI1640种类RPMI—1640（A）（不含谷氨酰胺、可高压灭菌）RPMI—1640

（含谷氨酰胺、过滤灭菌）

细胞培养基本技术第55页DMEM细胞培养基

是在MEM培养基基础上研制与MEM比较增加了各种成份用量，同时又分为高糖型（4500g/L）和低糖型(1000g/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。

DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高压灭菌】

DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌过滤灭菌】

DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌过滤灭菌】

细胞培养基本技术第56页血清使用血清质量好坏是试验成败关键惯用血清胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，胎牛血清是品质最高。优质血清标准透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清灭活（消除补体活性）

56℃，30分钟。血清消毒：过滤除菌细胞培养基本技术第57页牛血清胎牛血清应取自剖腹产胎牛新生牛血清取自出生24小时之内新生牛小牛血清取自出生10～30天小牛使用浓度：普通为5～20％，最惯用是10％。细胞培养基本技术第58页何谓FBS、FCS、CS、HS?FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)

是相同意思，二者都是指胎牛血清，

FCS乃错误使用字眼，请不要再使用。CS(calfserum)

是指小牛血清HS(horseserum)

是指马血清

细胞培养基本技术第59页胎牛血清（FetalBovineSerum,FBS）:

屠宰怀孕母牛时候,经过心脏穿刺采血获取胎牛血清，新生牛（小牛）血清（Calfserum,CS）则采自出生10至14天小牛。

二者所含促细胞生长因子、促贴附因子、激素及其它活性物质等组份与百分比不一样。用途与使用方法也有所区分，比如一些细胞必需胎牛血清才能生长，而有些细胞只需小牛血清即可。普通来说，胎牛血清是品质最高，因为胎牛还未接触外界，血清中所含抗体、补体等对细胞有害成份最好。除了用于细胞培养外，这些牛血清还可用于封闭液、保护液和缓冲液等。细胞培养基本技术第60页血清解冻步骤逐步解冻法

–30℃或–80℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，普通用50ml无菌离心管可分装40～45ml。勿直接由–30℃至37℃解冻，因温度改变太大，轻易造成蛋白质凝结而发生沉淀。细胞培养基本技术第61页无机盐CaCl2

、KCl、MgSO4、

NaCl、NaHCO3

、NaH2PO4对调整细胞渗透压、一些酶活性及溶液酸碱度都是必须。细胞培养基本技术第62页谷氨酰胺细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要造成细胞生长不良甚至死亡。普通培养液中谷氨酰胺含量为1～4mmol/L。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃保留，临用前加入培养液。配制方法：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保留，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。谷氨酰胺双肽，如甘氨酰基谷氨酰胺。这种谷氨酰胺在溶液中稳定，并可与谷氨酰胺一样有效地被细胞利用。细胞培养基本技术第63页水：新鲜配置三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+缓冲液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20

加新鲜配置三蒸水或去离子水至1000ml

细胞培养用液配制细胞培养基本技术第64页人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量天然培养基（如血清）。

细胞培养基本技术第65页血清中含有：①各种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②各种金属离子；③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成份(likeUFO)细胞培养基本技术第66页完全培养基组成基础培养基80％一95％血清5％一20％碳酸氢钠2.0g/L青、链霉素各100卑位／毫升细胞培养基本技术第67页普通说来．含5％小牛血清培养基对大多数细胞能够维持细胞不死．但支持细胞生长普通需加10％血清．对于血清支持细因生长生物学效应已得到证实，但对血清中复杂成份至今还未完全清楚．血清中不但存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，所以在含血清培养基中培养细胞所反应生物学特征是细胞和复杂血清因子综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表示调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞．细胞培养基本技术第68页培养细胞生长方式及类型㈠贴附生长型细胞

必须贴附于底物才能生长细胞。从形态上大致分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态细胞。㈡悬浮生长型细胞

不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。见于各种造血系统肿瘤细胞四、细胞培养基本方法细胞培养基本技术第69页细胞贴附过程㈠贴附生长型细胞++++++++++++贴附物质带正电荷细胞带负电荷细胞培养基本技术第70页上皮样细胞

起源：起源于外胚层，内胚层细胞如：皮肤及其衍生物消化道，乳腺，肺泡上皮性肿瘤形态：类似体内上皮细胞

扁平，不规则多角形，中有圆形核

细胞培养基本技术第71页生长特点

易相连成片

相靠—紧密相连—成薄层—铺石状

生长时呈膜状移动极少脱离细胞群而单个活动

上皮型细胞细胞培养基本技术第72页SKOv3（卵巢癌细胞）

1.细胞种类：SKOv3（卵巢癌细胞）2.培养天数：传代后3d；

3.放大倍速：倒置显微镜X10；

4.培养基种类：DMEM+5%胎牛血清；

5.细胞状态与特征简述：细胞贴壁生长，生长速度较快。

CCL-149

1.细胞种类：大鼠肺泡上皮细胞；

2.培养天数：1d（种在48孔板中）；

3.放大倍速：倒置显微镜X20；

4.培养基种类：F12K+10%胎牛血清；

5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭形，透亮贴壁生长，3－4天传代一次，Giemsa染色。

细胞培养基本技术第73页成纤维细胞样细胞

起源：由中胚层间充质组织起源组织

如：真正成纤维细胞心肌，平滑肌，成骨细胞，内皮细胞形态：似体内成纤维细胞形态

胞体梭形或不规则三角形胞质向外伸出2—3个长短不等突起

中有卵圆形核细胞培养基本技术第74页

生长特点

排列成放射状，漩涡状

并不紧靠连成片，

细胞—细胞接触易断开而

单独行动游离单独成纤维样细胞，

常有几个伸长细胞突起

细胞培养基本技术第75页

HUVECs人脐静脉内皮细胞

1.细胞种类：人脐静脉内皮细胞；

2.培养天数：4d；原代培养；

3.放大倍速：倒置显微镜X20；

4.培养基种类：M199+15％胎牛血清；

5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭形，扁平形或多角形，贴壁生长。

骨髓间充质干细胞

1.细胞种类：人骨髓间充质干细胞原代；

2.培养天数：7天；

3.放大倍数：200倍，倒置显微镜；

4.培养基种类：DF12+10％FBS；

5.细胞状态与特征简述：使用percoll密度梯度离心法分离人骨髓细胞。首次换液48h，这是7天后骨髓间充质干细胞扩增情况。

细胞培养基本技术第76页每代贴壁细胞生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长久停顿期（平台期）细胞培养基本技术第77页游离期细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。吸附期

贴附底物，普通24小时内贴壁。潜伏期

此时细胞有生长活动，基本无增殖。细胞株潜伏期普通为6～24小时。对数生长久

细胞数随时间改变成倍增加，活力最正确，最适合进行试验研究。停顿期（平台期）

细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性细胞培养基本技术第78页密度抑制（Densityinhibition）或接触抑制（Ccontactinhibition）1958年Abercrombie等学者提出一个现象，培养细胞再生长过程中多发生分裂增殖，细胞移动而相互靠近，这时一些细胞可移向其它方向，确保细胞不会重合，一但接触，这种活动即可停顿。所谓接触抑制实际使细胞汇合形成单层时，细胞变得拥挤，与培养液接触表面区域也对应降低，营养成份消耗，其分裂也将停顿。细胞培养基本技术第79页悬浮生长型细胞起源：血，脾或骨髓，尤以血中白细胞肿瘤细胞特点：在悬浮中生长良好细胞，圆形优点：生存空间大，提供数量大，

传代方便，易于收获，可获得稳定状态缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)细胞培养基本技术第80页

KU812

1.细胞种类：人嗜碱细胞性白血病细胞系；

2.培养天数：5d；

3.放大倍速：倒置显微镜X20；

4.培养基种类：RPMI1640+10%新生牛血清；

5.细胞状态与特征简述：细胞呈圆形，悬浮生长。

细胞培养基本技术第81页

K562细胞

1.细胞种类：K562（人慢性红白血病细胞株）；

2.培养天数：传代后2天；

3.放大倍数：倒置显微镜X10；

4.培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清，4mMGlutamine；

5.细胞状态与特征介绍：悬浮生长，少数贴壁，喜爱成团悬浮。

细胞培养基本技术第82页1．悬浮生长细胞传代

细胞传代方法直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清洗掉1/2~1/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代。离心法：离心800~1000rpm，5min，除上清，加新培养液，然后传代接种。部分贴壁生长细胞直接吹打传代或需消化后传代细胞培养基本技术第83页直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清洗掉1/2~1/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代。离心法：离心800~1000rpm，5min，除上清，加新培养液，然后传代接种。部分贴壁生长细胞直接吹打传代或需消化后传代细胞培养基本技术第84页吸除瓶内旧培养液；加入1ml消化液；37C或室温25C消化2~5分钟显微镜下进行观察，发觉胞质回缩、细胞间隙增大后；直接加少许含血清培养液，终止消化；细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液计数，分别接种在新培养瓶内。2．贴壁生长细胞传代

采取酶消化法传代。惯用消化液是0.25％胰蛋白酶液。细胞培养基本技术第85页首次传代注意事项

细胞生长密度不高时，不能急于传代原代培养贴壁细胞需控制消化时间吹打已消化细胞应降低机械损伤首次传代时细胞接种数量要多一些首次传代培养pH应偏低些小牛血清浓度可加大至15%～20%左右

细胞培养基本技术第86页细胞计数计数结果以每毫升细胞数表示细胞计数原理和方法与血细胞计数相同血细胞计数器：手工计数细胞Coulter计数仪：人工计数细胞培养基本技术第87页细胞计数步骤1、将血球计数板及盖片擦拭洁净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数。细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×104

注意：压线细胞只计左侧和上方。

镜下偶见由两个以上细胞组成细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。细胞培养基本技术第88页细胞培养基本技术第89页细胞培养基本技术第90页五、培养细胞活力测定细胞活力：

总细胞中活细胞所占百分比。由组织中分离细胞普通也要检验活力，以了解分离过程对细胞是否有损伤作用。复苏后细胞也要检验活力，了解冻存和复苏效果。细胞培养基本技术第91页测定方法台盼蓝法活细胞不被染色，死细胞染成蓝色。流式细胞仪细胞活性指标通常包含细胞膜对核酸染料通透性，代谢活性，膜电位等。细胞培养基本技术第92页四唑盐（MTT）比色法MTT比色法原理：

活细胞中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水蓝紫色产物甲臢（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功效。

二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含formazan量成正比。甲臢染料在A570nm处产生吸收值，用酶标仪测定A值。细胞培养基本技术第93页六、细胞冻存和复苏细胞深低温保留基本原理是：在－80℃以下时，细胞内酶活性均己停顿，即代谢处于完全停顿状态，故能够长久保留。细胞低温保留关键：在于经过0~-20℃阶段处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞严重损伤。细胞培养基本技术第94页

冻存和复苏标准：慢冻快融当细胞冷到零度以下，能够产生以下改变：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内