第三章-环境毒理学的基本研究方法

第三章

环境毒理学的基本探讨方法毒理学试验调查探讨毒理学

试验基础

探讨方法流行病学探讨受控的临床探讨毒理学体内试验毒理学体外试验优点·真实的暴露条件·规定的限定暴露条·易于限制暴露条件·影响因素少，易于控·在各化学物之间发生相·在人群中测定反应·能测定多种效应制互作用·对某组人群(如哮喘)·能评价宿主特征的作用·可进行某些深化的研·测定在人群的作用的探讨是有力的(如：性别、年龄、遗究(如：机制，代谢)·表示全部的人敏感性·能测定效应的强度传特征等和其他调控因·人力物力花费较少素饮食等)·能评价机制缺点·耗资、耗时多·耗资多·动物暴露与人暴露相关·不能全面反映毒作用·多为回顾性，无健康·较低浓度和较短时的不确定性不能作为毒性评价和爱护间的暴露·受控的饲养条件与人的危急性评价的最终依·难以确定暴露，有混杂·限于较少量的人群实际状况不一样据暴露问题(一般<50)·暴露的浓度和时间的模·难以视察慢性毒作用·可检测的危急性增加必·限于短暂、微小、式显著地不同于人群的需达到2倍以上可逆的效应暴露·测定指标较粗(发病率，·一般不适于探讨最死亡率)敏感的人群毒理学探讨方法的优缺点1试验动物和人对外源化学物的反应敏感性不同，有时甚至存在着质的差别2高剂量向低剂量外推的不确定性3小数量试验动物到大量人群外推的不确定性4成年健康动物向年老体弱及患病个体外推的不确定性试验动物的毒理学试验资料外推到人群接触的平安性时的不确定性1化学物在试验动物产生的作用，可以外推于人。基本假设①人是最敏感的动物物种；②人和试验动物的生物学过程与体重(或体表面积)相关。2试验动物必需暴露于高剂量，这是发觉对人潜在危害的必需的和牢靠的方法。

3成年的健康(雄性和雌性未孕)试验动物和人可能的暴露途径是基本的选择。描述毒理学试验的基本原则1受试物毒作用的表现和性质

2剂量—反应(效应)探讨

3确定毒作用的靶器官

4确定损害的可逆性毒理学毒性评价试验的基本目的试验动物（laboratoryanimal）指经人工培育，对其携带微生物实行限制，遗传背景明确，来源清晰，可用于科学探讨的动物。试验动物的选择试验动物的选择物种选择

选择对外液化学物的毒性反应及代谢特点与人类接近的物种；选择自然寿命不太长的物种；选择易于饲养和试验操作的物种；选择经济并易于获得的物种。

近交系动物连续20代以上兄妹交配或亲子交配培育突变系动物突变的基因可世代相传并保持遗传基因特性杂交群动物两个不同近交系之间有目的进行交配，所产生的第一代动物，亦称杂交一代动物。封闭群动物5年以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系的动物在固定场所保存繁殖的动物群

试验动物的选择品系选择无菌动物体内外均无任何微生物和寄生虫无特定病原体动物（SPF）体内无特定微生物和寄生虫存在的动物(无传染病)。饲养于封闭的系统。清洁动物与SPF的不同：抗体检查常有脑脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒等抗体滴度，但不应有临床症状、病理变更及自然死亡。饲养在半屏蔽系统。微生物限制的选择试验动物的选择个体选择

1年龄2性别3生理状态4健康状况

试验动物的选择

品系周龄 Wistar SD 雌性 雄性 雌性 雄性 3 54 56 50 52 4 91 97 86 101 5 134 134 130 150 6 166 187 172 206 7 209 233 210 262 8 214 297 240 318 9 232 325 258 365 10 246 370 272 399 大鼠体重与周龄的关系

小鼠体重与周龄的关系

品系周龄 昆明 BALB/c C57BL/6 615 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性

0 1.95 2.10 1.40 1.46 1.40 1.44 1.58 1.58 1 5.54 5.82 3.35 3.50 3.42 3.50 4.64 4.64 2 7.90 8.35 5.50 5.60 5.55 5.60 7.96 7.96 3 13.55 14.80 7.32 7.40 6.40 6.90 9.83 9.83 4 21.35 22.60 11.60 12.45 12.20 12.57 15.75 19.00 5 27.90 33.25 14.75 16.10 16.90 18.10 20.75 22.58 6 32.80 39.25 15.60 17.40 18.40 20.50 21.88 25.96 7 34.70 39.90 16.10 18.65 19.00 21.60 23.12 27.96 8 34.80 40.05 18.16 20.25 20.25 22.40 24.16 28.83 1未处理比照组(空白比照组)：本底值，质量限制2阴性(溶剂／赋形剂)比照：与染毒组比较的基础3阳性比照：检测试验体系的有效性4历史性比照：检查试验体系的稳定性，即进行试验室质量限制和保证

毒理学试验常用比照对各个毒理学试验应当用同一种、同一批号受试物受试物成分和配方必需固定

如是异构体混合物，异构体比例必需固定

活性成分的百分含量和可检测的杂质的浓度也应固定

受试物在贮存期内稳定性和在饲料中的稳定性必需进行探讨并报告

受试物应一次备齐全部试验的用量受试样品毒理学试验设计的统计学要求随机、重复、比照原则对常规毒理学试验资料的统计学方法计量资料：一般用t检验或ANOVA记数资料：卡方检验毒理学试验的统计学1处理组与比照组比较差别有无显著性2有无剂量-反应关系3是否伴有其他相关参数的变更4是否在“正常”值范围试验结果的推断第一节急性毒性试验一、急性毒性试验的目的：1、确定供试化学物急性毒性的剂量—反应关系和中毒特征；2、求LD50或LC50,为急性毒性评价供应依据。3、探讨毒物的毒动学和毒效学过程。表示急性毒性大小：

LD50(对受试物的个体感受性影响较小，有更高的重现性)二、试验程序与评价1．动物选择：首选受试物在体内代谢状况与人体内相近的或对受试物最敏感的品系。一般：以哺乳动物为主，常用大鼠、小鼠；经皮：兔、豚鼠、猪应对两种性别、成年和幼年动物进行测定。选择两种以上的试验动物，最好一为啮齿类，一为非啮齿类。(目的：核对种间差异)2．染毒途径与方式：一般与人的接触途径相同。(1)经口染毒：常用灌胃法，也可将受试物放在饮水中由动物自由摄取。(2)经呼吸道染毒：将试验动物放在有毒气或粉尘的染毒柜内进行染毒。急性吸入染毒接受静式染毒瓶(柜)，染毒2—4h。(3)经皮肤染毒：主要用于化学物经皮(或粘膜)吸取所引起的急性毒性。正式给药前24h，背部脱毛，勿伤皮肤。将受试物匀整涂布于皮肤表面，用纱布覆盖，共敷24h。3．试验程序：（1）剂量与分组①预试验：找出受试物大致致死量范围(死亡率为10%~90%)；例：欲做化合物A的经口预试验。化合物B的化学结构与A相像，已知B的=LD50=40(预期毒性中值)。则预试验取2.5、10、40、160、640(上下各推1~2组，组距应较大，初始4倍差)

③求LD50正式试验：在LD100与LD0之间设5—7个剂量组。

组距(对数)

或式中：n------设计的剂量组数（2）症状视察时间：24h或两周内的反应三、LD50的计算与结果评价

计算方法：概率单位法和寇氏法。LD50值愈小，毒性愈大。概率单位法存在正态曲线关系。标准正态差d=(x-μ)/δ式中：x——剂量对数；μ——剂量对数均数δ——标准差d=0，左边面积(死亡率)为50％，右边面积(存活率)50％d=1，死亡率为84.13％，d=2，死亡率为97.73％,d＞2，死亡率接近100％。d=一1，死亡率为15.87％。d=一2，死亡率为2.27％。d＜一3，死亡率接近0。从上表，可以任一死亡率换算为相应的概率单位。A：剂量对数~死亡百分率B：剂量对数~概率单位LC50计算步骤如下：a.依据死亡率查概率单位(死亡率为100％或0％不计)b.绘图求回来方程。c.求y=5的浓度对数（m），其反对数即为LC50y=2.78x-2.76同理可得LC5、LC10、……d.求LC50的可信限先求LC50的标准误差(Sm)：S(校准差)=1/k本例中：S=1/2.78

平均致死量法（又名寇氏法）

试验要求：①每个试验组动物数相同；②各组剂量按等比级数分组；③最大剂量的死亡率最好为100％或与之接近，最小剂量的死亡率最好为0％或与之接近。式中：Xm——最大剂量的对数值；i—相邻剂量比值的对数；——各组死亡率的总和（以小数表示）。例小鼠腹腔注射致百虫急性毒性试验结果如下表所示，求LD50式中：p——一个组死亡率；q——一个组存活率；i——相邻剂量比值的对数；h——各组动物数。其次节亚慢性和慢性毒性试验一、蓄积试验及其方法：（一）蓄积作用：某些物质以较小剂量反复作用于机体，可使机体对该物质的反应性增加，即一次染毒不引起明显中毒反应或死亡的剂量，经分次重复染毒后，可引起明显中毒或死亡，此种现象称为蓄积作用(accumulation)。可分两种：物质蓄积：毒物在体内的排出量小于进入量，以致毒物在体内的贮留量增多为物质蓄积；功能蓄积：毒物进入机体后，并未发觉在体内明显贮留，但可引起机体功能变更的渐渐累积，导致对该毒物的反应性增加。耐受性(tolerance)：机体多次接触化学物质后．对该物质产生反应性减弱的现象，显示不易发生慢性中毒。

（二）蓄积作用的测定方法有多种，常用蓄积系数法。蓄积系数(accumulationcoefficient)K：

ED50(n)——多次染毒使半数动物出现某种效应的总剂量;ED50(1)——一次染毒引起同一效应半数效量。若以死亡为毒效应指标，上式为K越小，受试化合物的蓄积毒性越大。K蓄积作用强度＜1高度蓄积1~3明显蓄积3~5中度蓄积＞5轻度蓄积1．固定剂量法：固定每天染毒剂量为1/20—1/5LD50，连续染毒，直至试验动物半数死亡。假如染毒剂量累计已达5个LD50动物死亡仍末达半数，试验均可告结束，计算蓄积系数，作出评价。2．递增剂量法：先测定LD50（1），然后对另一组动物每天染毒，以4天为一期，起先赐予0.1LD50。以后每期按1.5倍递增剂量，直至动物半数死亡，或试验已达28天，可结束试验，计算系数。3.二十天试验法：选用大鼠或小鼠每个剂量组雌雄各10只，以1/2、l/5、1/10、1/20LD50分别对每组进行染毒，每日1次，共20天。如l/20LD50组动物有死亡，且有剂量—反应关系，则有较强蓄积作用；如1/20LD50组无死亡，则为弱蓄积。蓄积系数的测定二、亚慢性毒性作用及其试验方法：1、目的：确定化学物亚慢性毒性的阈剂量和NOEL。2、试验期限：3-6月；呼吸道吸取：30-90天；皮肤毒性：30天。3、试验动物的选择、饲养环境及染毒途径：试验动物选择：对受试化学物敏感的物种或品系；环境：养分合理，饮水清洁、足够、温、光、湿适宜；染毒途径：尽量模拟人类在环境中接触受试化学物的途径，与急性毒性试验相像。4、剂量选择与分组剂量：1／80—I／50LD50，对于在体内不产生蓄积作用而排泄又快的物质可适当加大剂量，反之则可削减剂量。设3—4个试验组和1个比照组。试验组要求：在试验结束时最低剂量组不产生可视察到的毒性反应；最高剂量组能引起明显毒性反应，但不引起死亡；中间剂量组产生稍微毒性反应。5、症状视察一般性指标(非特异)①一般综合性指标：动物体重增长率、食物消耗率、活动实力等。②一般化验性指标：主要指血和肝、肾功能的检测。(2)特异指标：测定特异性反应。更准确阐明该物质的阈剂量(浓度)及无作用剂量(浓度)。(3)病理组织学检查：试验中死亡动物的病理检查及试验结束时的尸检。三、慢性毒性作用及其试验方法1、目的：评价化学物在长期小剂量作用的条件下对机体产生的损害及其特点．确定阈剂量和最大无作用剂量。2、试验方法：（1）动物选择、染毒方法、视察指标等与亚慢性毒性试验相像；（2）染毒期限：1-2年或终身染毒，也有人提出6月。（3）剂量分组：3个染毒组和一个比照组。高剂量组：1/5—1/2亚慢性试验阈值；中间剂量：1/50—1/10；低剂量组：1/100。第四节致突变试验一、目的确定外源化学物对生物体是否具有致突变作用。基因点突变试验、染色体畸变试验、DNA损伤试验。二、供试生物：微生物、动物细胞、昆虫、动物或植物三、试验方法体外基因突变试验、细胞遗传学试验、体内基因突变试验、DNA损伤试验（一）体外基因突变试验1、Ames试验（鼠伤寒沙门氏菌/动物肝细胞微粒体试验）

（1）原理：利用一种突变微生物菌株与被检测化学物接触，使突变型微生物回复突变，重新成为野生型微生物。突变型微生物不具备合成组氨酸的实力，不能在不含（或低浓度）组氨酸培育基上生长。（2）方法：将突变型沙氏菌在不含（或低浓度）组氨酸培育基上培育,以其生长状况作为指标。在培育基中加入哺乳动物的肝细胞微粒体：提高灵敏度。（3）特点：优点：简便、灵敏、快速（48h）、费用低；检测结果与对动物的致癌性的相符率达约90%。

缺点：利用微生物作为供试物，不能全面反映哺乳动物的遗传信息，仅1/6；微生物的DNA修复系统与动物有差异；微生物无免疫功能。

2、哺乳动物体细胞突变试验（1）方法原理与微生物突变类似。

常用的细胞株：中国地鼠肺细胞V79中国地鼠肺卵巢细胞(CHO）小鼠淋巴瘤L5178Y细胞株。V79、CHO细胞株正常细胞：缺乏利用嘌呤碱的酶HGPRT，不能在加入类嘌呤碱类物质的培育基上生长；突变细胞：可在加入类嘌呤碱类物质的培育基上生长。L5178Y突变细胞株正常细胞：缺乏胸苷激酶（TK），不行在含有细胞毒物5-溴脱氧尿苷的培育基上生长。突变细胞：可在此种培育基上生长。（二）细胞遗传学试验染色体畸变试验：干脆在显微镜下视察染色体结构和数目的变更状况。生殖细胞或体细胞、体外或体内试验。体外：CHO细胞:分裂快、数目适中、形态清晰；人类外周血淋巴细胞体内：受试动物骨髓细胞或其他（胸腺、脾、精原细胞）染色体畸变率的变更。（1）试验方法：a.体外培育：CHO细胞或人类外周血淋巴细胞与化学物，在细胞培育液（DMEM,RPM,1640或1999）中，370C下培育24h(CHO)或72h(人类细胞）。视察前2h加入秋水仙碱（中期分裂阻断剂），制片，镜检视察。b.体内染色体畸变分析：大鼠、小鼠，染毒饲养，视察骨髓细胞染色体畸变状况。第四节环境流行病学方法一、概念和特点：流行病学：探讨特定人群中有关健康的状态和事务的分布以及影响这些分布的确定因素；环境流行病学：应用流行病学的原理和方法，重点探讨人们在生活和工作环境中各种因素与人群健康的关系。一般流行病学探讨的内容是疾病在人群中的分布，它要回答三个问题：(1)疾病在时间、地点、不同人群中是怎样分布的?(2)什么因素是该病的主要确定因素?(3)怎样限制该病的流行?环境流行病学除了上述一般内容，还有它本身的特点。(1)它不仅探讨疾病的分布规律，而且更常常地探讨疾病前的状态，即包括无异样〔健康)、微弱的功能变更、疾病的前期(亚临床状态)等各种健康状况，揭示环境污染或某些微量元素的健康效应。(2)环境流行病学探讨的暴露因素主要是理化因素。①已知暴露因素，探讨其对健康的影响；环境毒理学工作者所进行的大量工作就属于这种。例如金属冶炼厂铅污染大气对居民健康影响，磷肥厂氟污染大气对居民健康影响的调查等。②出现健康异样，追究引起异样的暴露因素，这属于探讨病因的探讨。例如，近年来我国学者对于鼻咽癌、食道癌病因的探讨，对克山病、大骨节病病因的探讨，均属于此种类型。日本的水误病和痛痛病的病因是重金属污染造成的公害病领域里的探讨成果，影响深远。(3)环境流行病学探讨的最终日的是为消退污染、改造环境、爱护居民健康服务。(4)干脆以人群为探讨对象，探讨结果最具有劝服