基因定位常用的方法

关于基因定位常用的方法1第1页，共34页，2023年，2月20日，星期三2

明确几个基本概念基因：DNA的功能片段。基因组：有机体全部DNA序列（它包括基因外的非基因DNA序列），它是基因和非基因DNA序列的总和。基因定位：是用一定的方法将基因确定到染色体的实际位置。第2页，共34页，2023年，2月20日，星期三3遗传做图：是以研究家族的减数分裂，以了解两个基因分离趋势为基础来绘制基因座位间的距离，它表明基因之间连锁关系和相对距离，并以重组率来计算和表示，以厘摩（cM）为单位。染色体定位：只把基因定位到某条染色体上。细胞水平上的基因图又称细胞遗传图区域定位：从细胞遗传学水平，用染色体显带等技术在光学显微镜下观察，将基因定位到染色体的具体区带。第3页，共34页，2023年，2月20日，星期三4一、基因定位的方法1、体细胞杂交法基因定位：体细胞：即生物体除生殖细胞外的任一细胞。1）体细胞杂交的概念：也称细胞融合（cellinfusion），是将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞。新产生的细胞称杂种细胞（hybridcell），含双亲不同的染色体。第4页，共34页，2023年，2月20日，星期三5

2）对象：人的细胞鼠类：大鼠、小鼠、仓鼠

3）杂种细胞的特点：在繁殖传代过程中，人的染色体优先丢失，以至最后只剩几条或一条人的染色体，而啮齿类的染色体被保留下来。第5页，共34页，2023年，2月20日，星期三64）原理：细胞进行融合时，培养液中只有部分细胞融合成杂种细胞，还有大量未融合的双亲细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。为此要创造一种只让杂种细胞生长繁殖而亲本细胞死亡的环境。这就要利用杂种细胞和亲本细胞对生长条件的要求和代谢的差异来进行选择。其中最常用的是HAT选择系统。第6页，共34页，2023年，2月20日，星期三7HAT选择系统：

人的突变细胞株：缺乏HGPRT酶小鼠细胞株：缺乏TK酶两者融合培养于HAT培养基中

HAT培养基：

H为次黄嘌呤，是HGPRT的底物，为DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）

A可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑制）

T在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为DNA合成提供原料第7页，共34页，2023年，2月20日，星期三8因此在HAT培养基上

人细胞：①由于A的存在，正常的DNA合成通路受阻。②同时由于HGPRT的缺乏，无法利用次黄嘌呤通过旁路合成DNA（嘌呤合成障碍）

第8页，共34页，2023年，2月20日，星期三9鼠细胞：由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，有HGPRT可以利用次黄嘌呤合成腺嘌呤，鸟嘌呤，但由于无TK，无法合成胸腺嘧啶。（嘧啶合成障碍）

杂种细胞：有HGPRT旁路合成腺嘌呤,鸟嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶（嘌呤和嘧啶都可以正常合成）

第9页，共34页，2023年，2月20日，星期三10

将筛选出来的杂种细胞转移到正常培养基继续培养，由于人和鼠都有各自不同的生化和免疫学特性，Miller等运用体细胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种细胞的存活需要胸苷激酶（TK）。凡是含有人17号染色体的杂种细胞都因有TK活性而存活，反之则死亡，从而推断TK基因定位于17号染色体上，这是首例应用体细胞杂交法进行的基因定位。第10页，共34页，2023年，2月20日，星期三11第11页，共34页，2023年，2月20日，星期三12②克隆嵌板法(clonepanelmethod)

根据不同杂种细胞保留或丢失的人染色体有时是重叠的情况,设计的一种简便而实用的基因定位方法。

克隆嵌板

杂种克隆保留的人染色体

12345678A++++----B++--++--C+-+-+-+-第12页，共34页，2023年，2月20日，星期三132.原位杂交和荧光原位杂交

1）原位杂交（insituhybridization）：是最直接的基因定位方法之一，是分子生物学技术在基因定位中的应用，胰岛素基因用此方法定位于11p15。

2）原理：碱基的互补配对，同源的DNA-DNA双链或DNA-RNA双链在一定条件下能结合成双链。用放射性或非放射性物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补的cDNA作探针，可检测细胞基因组中的同源部分。第13页，共34页，2023年，2月20日，星期三143）原位杂交的特点：杂交在载玻片上的中期染色体上进行，而不是在溶液和膜上进行。所谓原位是指在标本上DNA原位变性，再与放射性或非放射性物质（通常用3H）标记的已知核酸探针杂交，通过放射自显影来检测染色体上特异DNA或RNA顺序，用放射性颗粒在某条染色体的区带出现的最高频率或荧光的强度来确定探针的位置，从而准确地进行基因定位。第14页，共34页，2023年，2月20日，星期三154）原位杂交的步骤

制备中期染色体

DNA原位变性

变性放射性或非放射性标记探针

杂交（在载玻片上）

洗膜

放射性标记：放射自显影

检测非放射性标记：荧光染料与抗体或蛋白结合记录杂交信号结合染色体形态进行基因定位第15页，共34页，2023年，2月20日，星期三165）荧光原位杂交

（florescenceinsituhybridization，FISH）

用特殊荧光素（dig或Biotin）标记探针DNA（Nicktranslation标记法），变性成单链后与变性后的染色体或细胞核靶DNA杂交。在荧光显微镜下观察并记录结果。FISH优点：可用来作基因或特定DNA片段的染色体区域定位。缺点：必须在已知探针的情况下方可进行。第16页，共34页，2023年，2月20日，星期三17单色FISH第17页，共34页，2023年，2月20日，星期三18

多色FISH第18页，共34页，2023年，2月20日，星期三193.连锁分析（Linkageanalysis）1）概念：基因定位的连锁分析是根据基因在染色体上呈直线排列，不同基因相互连锁成连锁群的原理，即应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的特点进行定位。第19页，共34页，2023年，2月20日，星期三202）重组值（recombinationfraction）是基因定位时两个基因间遗传图距的量度，即基因间的遗传距离。如果两个基因间有1%的重组值，其遗传图的距离为1厘摩。（centimorgan，cM）3）遗传标记（geneticmarker）用连锁分析发法进行基因定位需要已知的记忆内作为遗传标记，这些标记按孟德尔方式遗传，标记位点应是多态的。第20页，共34页，2023年，2月20日，星期三21第21页，共34页，2023年，2月20日，星期三22致病基因和标记座的连锁第22页，共34页，2023年，2月20日，星期三23遗传多态性：是指在一个遗传座位上具有一个以上的等位基因，且各个等位基因在群体中出现的频率皆高于1%。常用的遗传标记：

①ABO血型蛋白多态

②血清蛋白泳动学改变

③HLA

④RFLP小卫星DNA：VNTR6-12个核苷酸DNA多态

⑤VNTR微卫星DNA：STR2-6个的VNTR

⑥SNPs第23页，共34页，2023年，2月20日，星期三24

二、基因克隆致病基因克隆有两种基本策略功能克隆定位克隆

1、功能克隆(functionalcloning)

是利用疾病已知的遗传损伤而引起的生化功能如蛋白质氨基酸缺陷的信息,进行基因定位,进而克隆该基因.

第24页，共34页，2023年，2月20日，星期三252、定位克隆(positionalcloning)

是先进行基因定位作图,然后找到来自该定位区的基因并进行克隆,在此之后才能明确该基因的功能.

功能克隆和定位克隆的比较:

在传统的功能克隆中,基因功能的研究先于基因鉴定.在定位克隆中,基因定位在先,最后再鉴定基因.基因已鉴定后,可以进行基因功能的选择性研究.

第25页，共34页，2023年，2月20日，星期三26第26页，共34页，2023年，2月20日，星期三27

定位克隆鉴定的第一批基因利用了特定基因座的染色体畸变，Duchenne肌营养不良(DMD)基因的克隆是一个重要的例子。第27页，共34页，2023年，2月20日，星期三28假肥大型肌营养不良症(DMD/BMD)

由于抗肌萎缩蛋白(dystrophin)遗传性缺陷所致的进行性肌萎缩的致死性神经肌肉性遗传病,发病率为1/3500，XR遗传。

主要症状:通常3---5岁发病,开始走路不稳,鸭型步态,上楼梯困难,Gower征阳性.进行性肌萎缩伴有腓肠肌假性肥大,10多岁下肢瘫,一般在20多岁之前死于心衰或呼吸衰竭.第28页，共34页，2023年，2月20日，星期三29DMD基因克隆的方法

研究者们通过对几个女性患者的细胞遗传学研究发现每个病例受累的常染色体不同但在X染色体上的断裂点总是p21。同时一个无任何遗传缺陷家族史的男孩被发现患有DMD等4种X连锁隐性遗传病，在这个独一无二个体的引发下，经过仔细的遗传学研究，最终发现了Xp21.1的微小缺失。第29页，共34页，2023年，2月20日，星期三30DMD女性患者的核型第30页，共34页，2023年，2月20日，星期三31X染色体与常染色体易位时X染色体失活的结果第31页，共34页，2023年，2月20日，星期三32两个研究