蛋白质的结构与功能

生物化学与分子生物学蛋白质的结构与功能第一章StructureandFunctionofProtein什么是蛋白质?蛋白质(protein)是由许多氨基酸(aminoacids)通过肽键(peptidebond)相连形成的高分子含氮化合物。蛋白质研究的历史1833年，Payen和Persoz分离出淀粉酶。1838年，荷兰科学家G.J.Mulder引入“protein”（源自希腊字proteios，意为primary）一词

1864年，Hoppe-Seyler从血液分离出血红蛋白，并将其制成结晶。19世纪末，Fischer证明蛋白质是由氨基酸组成的，并将氨基酸合成了多种短肽。1951年,

Pauling采用X（射）线晶体衍射发现了蛋白质的二级结构——α-螺旋(α-helix)。1953年，FrederickSanger完成胰岛素一级序列测定。1962年，JohnKendrew和MaxPerutz确定了血红蛋白的四级结构。20世纪90年代以后，随着人类基因组计划实施，功能基因组与蛋白质组计划的展开，使蛋白质结构与功能的研究达到新的高峰。蛋白质的分子组成

TheMolecularComponentofProtein第一节蛋白质的生物学重要性分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是生物体中含量最丰富的生物大分子，约占人体固体成分的45%，而在细胞中可达细胞干重的70%以上。1.蛋白质是生物体重要组成成分作为生物催化剂（酶）代谢调节作用免疫保护作用物质的转运和存储运动与支持作用参与细胞间信息传递2.蛋白质具有重要的生物学功能3.氧化供能组成蛋白质的元素主要有C、H、O、N和S。

有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘。

各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％。由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数×6.25×1001/16%蛋白质元素组成的特点一、组成人体蛋白质的20种L--氨基酸

存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属L-α-氨基酸（脯氨酸属于L--亚氨基酸，而甘氨酸则属于-氨基酸）。H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式RC+NH3COO-H-氨基酸的立体异构体（一）-氨基酸的立体异构体（二）非极性脂肪族氨基酸（6）极性中性氨基酸（6）芳香族氨基酸（3）酸性氨基酸（2）碱性氨基酸（3）二、氨基酸可根据侧链结构和理化性质进行分类(一)侧链含烃链的氨基酸属于非极性脂肪族氨基酸(二)侧链有极性但不带电荷的氨基酸是极性中性氨基酸甲硫氨酸(三)侧链含芳香基团的氨基酸是芳香族氨基酸(四)侧链含负性解离基团的氨基酸是酸性氨基酸(五)侧链含正性解离基团的氨基酸属于碱性氨基酸几种特殊氨基酸

脯氨酸（亚氨基酸）CH2CHCOO-NH2+CH2CH2CH2CHCOO-NH2+CH2CH2半胱氨酸+胱氨酸二硫键-HH-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3三、20种氨基酸具有共同或特异的理化性质两性解离及等电点氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。等电点(isoelectricpoint,pI)

在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。（一）氨基酸具有两性解离的性质pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性离子阳离子阴离子（二）含共轭双键的氨基酸具有紫外吸收性质色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm

附近。大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。芳香族氨基酸的紫外吸收（三）氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。四、氨基酸通过肽键连接而形成蛋白质或活性肽肽键(peptidebond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。（一）氨基酸通过肽键连接而形成肽+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键肽(peptide)是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽……肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。N末端：多肽链中有游离α-氨基的一端C末端：多肽链中有游离α-羧基的一端多肽链有两端：多肽链(polypeptidechain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。…肽链的两个末端氨基酸残基肽键氨基末端羧基末端多肽链的形成及其方向性多肽链的主链骨架应该是

H2N-C-C—N-C-C—N-C-C……的重复。

AA残基中的R基不参与成键,伸展向外。

N末端C末端牛核糖核酸酶（二）体内存在多种重要的生物活性肽1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)GSH过氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH还原酶NADPH+H+NADP+GSH与GSSG间的转换解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态；维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。谷胱甘肽的生理功用：2.多肽类激素及神经肽种类较多，生理功能各异。多肽类激素主要见于下丘脑及垂体分泌的激素，如促甲状腺素释放激素（3肽）、催产素（9肽）、加压素（9肽）、促肾上腺皮质激素（39肽）。神经肽主要与神经信号转导作用相关，包括脑啡肽（5肽）、-内啡肽（31肽）、强啡肽（17肽）等。牛催产素与加压素：

均为九肽，分子中含有一对二硫键，两者结构类似。前者第八位为Leu，后者为Arg。前者可刺激子宫的收缩，促进分娩。后者可促进小动脉收缩，使血压升高，也有抗利尿作用，参与水、盐代谢的调节。

牛催产素

SS Cys·Tyr·Ile·Gln·Asn·Cys·Pro·Leu·Gly-NH2

牛加压素

SS Cys·Tyr·Phe·Gln·Asn·Cys·Pro·Arg·Gly-NH2

脑啡肽：为五肽，具有镇痛作用，它们在中枢神经系统中形成，是体内自己产生的一类鸦片剂。Tyr--Gly--Gly--Phe--Leu蛋白质的分子结构

TheMolecularStructureofProtein

第二节蛋白质的分子结构包括:

高级结构一级结构(primarystructure)二级结构(secondarystructure)三级结构(tertiarystructure)四级结构(quaternarystructure)除一级结构外，蛋白质的二、三、四级结构都属于空间结构，即构象（conformation）。构象是由于有机分子中单键的旋转所形成的。蛋白质的构象通常由非共价键（次级键）来维系。定义:蛋白质的一级结构指在蛋白质分子从N-端至C-端的氨基酸排列顺序。一、氨基酸的排列顺序决定蛋白质的一级结构主要的化学键:肽键，有些蛋白质还包括二硫键。一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础，但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。二、多肽链的局部主链构象为蛋白质二级结构蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象

。定义:

主要的化学键：氢键

（一）肽单元参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元

(peptideunit)

。

-螺旋(-helix)

-折叠(-pleatedsheet)

-转角(-turn)

无规卷曲(randomcoil)

（二）蛋白质二级结构的主要形式-螺旋是多肽链的主链原子沿一中心轴盘绕所形成的有规律的螺旋构象，其结构特征为：⑴为右手螺旋；⑵螺旋每圈包含3.6个氨基酸残基，螺距为0.54nm；⑶螺旋以氢键维系。

⑷R基团的形状、大小及电荷影响其形成及稳定性-螺旋的结构特征影响-螺旋稳定的因素有：极大的侧链基团（存在空间位阻）；连续存在的侧链带有相同电荷的氨基酸残基（同种电荷的互斥效应）；有Pro等亚氨基酸存在（不能形成氢键）。-折叠-折叠是由若干肽段或肽链排列起来所形成的扇面状片层构象，其结构特征为：⑴主链骨架伸展呈锯齿状；⑵由若干条肽段或肽链平行或反平行排列组成片状结构；⑶借相邻主链之间的氢键维系。⑷R基团的大小会对其形成以及稳定性产生一定的影响。-折叠的结构特征-折叠的平行式与反平行式排列

-转角由主链本身发生180°的回折形成；回折部分通常由4个氨基酸构成；主要维持力是氢键。无规卷曲（randomcoil）：无规卷曲是指多肽链主链部分形成的无规律的卷曲构象。对于特定的蛋白质分子而言，其无规卷曲部分的构象则是特异的。核糖核酸酶分子中的二级结构α-螺旋β-折叠β-转角无规卷曲三、多肽链在二级结构基础上进一步折叠形成三级结构疏水键、离子键、氢键和范德华力等。主要的化学键:整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。定义:（一）三级结构是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置主要的化学键：维系三级结构的力主要有疏水键、氢键、离子键和范德华力等。尤其是疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用。蛋白质分子中氢键的形成H在蛋白质分子中，由于存在数目众多的氢键，故氢键在稳定蛋白质的空间结构上起着重要的作用。但氢键的键能较低(~12kJ/mol)，易被破坏。

蛋白质分子中离子键的形成

疏水键：非极性物质在含水的极性环境中存在时，会产生一种相互聚集的力，这种力称为疏水键或疏水作用力。蛋白质分子中的许多氨基酸残基侧链也是非极性的，这些非极性的基团在水中也可相互聚集，形成疏水键，如Leu，Ile，Val，Phe，Ala等的侧链基团。b+ccccbaaa维持蛋白质分子构象的各种化学键a氢键b离子键c疏水键三级结构中疏水键数量最多，往往居于球状蛋白质内部。+

含多种二级结构单元；是紧密的球状或椭球状实体；疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面。（一）球状蛋白质三级结构的特征

肌红蛋白(Mb)的三级结构153aa，1个血红素辅基。8个螺旋区占75%，螺旋之间有无规卷曲，pro（100、120）位于转角处。表面亲水；内部疏水纤连蛋白分子的结构域（二）结构域是三级结构层次上的局部折叠区大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个在空间上可明显区别的局部区域，各有独特的空间构象，并承担特定的生物学功能。Ig的结构域：CH1～H3重链恒定区结构域1、2、3；CL轻链恒定区结构域；VL轻链可变区结构域；VH重链可变区结构域；亚基之间的结合主要是氢键和离子键。四、含有二条以上多肽链的蛋白质具有四级结构蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。许多功能性蛋白质分子含有2条或2条以上多肽链。每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基(subunit)。由2个亚基组成的蛋白质四级结构中，若亚基分子结构相同，称之为同二聚体(homodimer)，若亚基分子结构不同，则称之为异二聚体(heterodimer)。血红蛋白的四级结构血红蛋白的空间结构血红蛋白4个亚基，这4个亚基都可以与氧结合运输氧，但每个亚基单独存在时难以释放氧，无运输氧作用不是所有的蛋白质都具有四级结构。亚基的种类,数目和亚基间缔合方式各不同。单独的亚基不具有活性。亚基间的聚合与疏松，聚合与解聚互为可逆，这也是调节蛋白质功能活性的一种方式。基本特征维持蛋白质四级结构的主要作用力

在蛋白质四级结构中，亚基之间的作用力主要包括：氢键、离子键、范德华力和疏水键。即亚基之间主要是通过次级键彼此缔合在一起。化学键共价键次级键肽键二硫键氢键疏水键盐键范德华力一级结构二、三、四级结构三、四级结构

蛋白质分子中的共价键与次级键蛋白质结构与功能的关系TheRelationofStructureandFunctionofProtein第三节（一）一级结构是空间构象的基础一、蛋白质一级结构是高级结构与功能的基础牛核糖核酸酶的一级结构二硫键

天然状态，有催化活性

尿素、β-巯基乙醇

去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性（二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能一级结构相似的多肽或蛋白质，其空间构象以及功能也相似。────────────────────────

氨基酸残基序号胰岛素───────────────

A5A6A10A30────────────────────────

人ThrSerIleThr

猪ThrSerIleAla

狗ThrSerIleAla

兔ThrGlyIleSer

牛AlaGlyValAla

羊AlaSerValAla

马ThrSerIleAla────────────────────────（三）氨基酸序列提供重要的生物进化信息一些广泛存在于生物界的蛋白质如细胞色素(cytochromeC)，比较它们的一级结构，可以帮助了解物种进化间的关系。（四）重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病例：镰刀形红细胞贫血N-val·his·leu·thr·pro·glu

·glu·····C(146)HbSβ肽链HbAβ肽链N-val·his·leu·thr·pro·val·glu·····C(146)

这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。肌红蛋白/血红蛋白含有血红素辅基血红素结构二、蛋白质的功能依赖特定空间结构（一）血红蛋白亚基与肌红蛋白结构相似肌红蛋白(myoglobin，Mb)

肌红蛋白是一个只有三级结构的单链蛋白质，有8段α-螺旋结构。血红素分子中的两个丙酸侧链以离子键形式与肽链中的两个碱性氨基酸侧链上的正电荷相连，加之肽链中的F8组氨酸残基还与Fe2+形成配位结合，所以血红素辅基与蛋白质部分稳定结合。血红蛋白(hemoglobin，Hb)血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构，每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧。Hb亚基之间通过8对盐键，使4个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。脱氧Hb亚基间和亚基内的盐键Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。（二）血红蛋白亚基构象变化可影响亚基与氧结合肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线协同效应(cooperativity)一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应(positivecooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应(negativecooperativity)O2血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。变构效应(allostericeffect)定义：当变构剂与蛋白质分子结合，使蛋白质的构象发生一定变化，从而导致其功能的变化。酶活性升高或降低蛋白质＋变构剂功能改变

Hb＋O2T型R型与氧的亲和力增大变构酶＋小分子构象改变变构蛋白

变构效应的结构基础是亚基间(蛋白质四级结构)的相互作用，它存在于多亚基蛋白和酶中，“S”曲线是变构效应的动力学特征。

与肌红蛋白以及单独存在的Ｈb的α或β亚基相比，因Ｈb属四级结构，构象改变且有亚基相传递而有变构效应，故有协同效应和可调功能，动力学曲线呈“Ｓ”型；肌红蛋白和单独存在的α或β亚基都是三级结构，一条肽链，虽能结合氧，亦有构象改变，但无亚基传递变构信息，不能形成变构效应和协同效应，动力学曲线呈矩形双曲线。

由此可见结构与功能的关系十分密切，结构相似功能相近，结构不同功效各异，结构变化功能亦随之变化，结构愈高级功能愈复杂。（三）蛋白质构象改变可引起疾病蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。疯牛病中的蛋白质构象改变第四节蛋白质的理化性质ThePhysicalandChemicalCharactersofProtein一、蛋白质具有两性电离的性质蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)二、蛋白质具有胶体性质蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。颗粒表面电荷水化膜蛋白质胶体稳定的因素:+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉三、蛋白质空间结构破坏而引起变性在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。蛋白质的变性(denaturation)造成变性的因素:如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。

变性的本质:——破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。变性蛋白质的性质改变：①物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；②化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶水解。③生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。

应用举例:临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。

若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)。

天然状态，有催化活性

尿素、β-巯基乙醇

去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。

蛋白质沉淀蛋白质的凝固作用(proteincoagulation)四、蛋白质在紫外光谱区有特征性吸收峰由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的A280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。五、应用蛋白质呈色反应可测定蛋白质溶液含量茚三酮反应(ninhydrinreaction)双缩脲反应(biuretreaction)第五节蛋白质的分离纯化与结构分析TheSeparationandPurificationandStructureAnalysisofProtein一、透析及超滤法可去除蛋白质溶液中的小分子化合物应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。透析(dialysis)超滤法利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是常用的蛋白质浓缩方法使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。盐析(saltprecipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。三、利用荷电性质可电泳分离蛋白质蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)

。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。