内毒素β葡聚糖和降钙素检测的临床应用

内毒素β葡聚糖和降钙素检测的临床应用第1页/共55页内毒素、1，3-β-葡聚糖和降钙素原检测的临床应用安徽省立医院检验科戴媛媛第2页/共55页内毒素概述内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁结构中的脂多糖（LPS），这些成分只在细菌死亡裂解后才释放到菌体外或活菌以发泡形式将其释出。第3页/共55页外层菌体多糖（O抗原），与细菌侵袭力有关。中层同一种属之间是相同的。内层特殊的糖磷脂，起毒性作用，而无种属特异性。特异性多糖核心多糖类脂A内毒素的结构第4页/共55页发热反应1激活血管活性物质的释放2激活凝血和纤溶系统3内毒素的生物学活性第5页/共55页直接或间接损害肝脏5激活白三烯、前列腺素及单核巨噬系统6内毒素的生物学活性激活补体4第6页/共55页第7页/共55页内毒素的有益作用增加机体非特异性免疫力1防御放射性损伤，促进粒细胞生成2增加网状内皮系统功能3抗肿瘤，免疫佐剂作用4第8页/共55页内源性内毒素血症外源性内毒素血症产生原因肠道内毒素的吸收1败血症时血中细菌的释放23有效的抗菌治疗后，细菌崩解输入了含有细菌的药物、血液或者体液等。第9页/共55页内毒素血症临床症状主要决定于宿主对内毒素的抵抗力。症状和体征有：发热，白细胞数变化，出血倾向，心力衰竭、肾功能减退、肝脏损伤、神经系统症状，以及休克、血压下降、组织灌流不足、缺氧及酸中毒等。

内毒素血症的临床症状最严重的后果：致死性感染性休克，多器官功能衰竭，DIC等。病死率极高。第10页/共55页肺炎100%、尿路感染70-80%、腹腔感染72-84%、烧伤85%、急性胰腺炎90%、败血症70%、急性肝炎37-64%、暴发性肝炎58-100%、丙肝61.54%、胆石症伴急性梗阻性化脓性感染85%、多器官功能衰竭100%。

各类疾病内毒素血症的发生率第11页/共55页内毒素检测的临床应用在肝胆疾病中的应用1在呼吸系统感染中的应用2在胰腺疾病中的应用3在溃疡性结肠炎中的应用4在全身性细菌感染中的应用5在不明原因发热中的应用6第12页/共55页内毒素检测在医院中的应用在医院灭菌制剂检验中应用1对注射器、输液器等医疗器械的内毒素检测2在透析站和血站中的应用3在临床医学研究中的应用4第13页/共55页鲎试验是1968年由Levin和Bang建立。其原理是利用鲎的变形细胞与微量内毒素产生凝集反应的现象，作为判断试品中细菌内毒素含量的一种方法。内毒素的检测方法第14页/共55页

背面观

就像是古代武士的心甲

腹面观

腹部基本呈六角形，

还可以看到它发达的附肢

第15页/共55页内毒素的检测原理GG第16页/共55页内毒素的检测方法鲎试剂（LimulusamebocytelysateLAL)

凝胶法——0.03EU/ml范围内半定量1浊度法——0.006-300EU/ml,检测范围大2比色法——0.006-15EU/ml范围内定量3ELISA——0.1pg/ml4流式细胞术——测内毒素的量而不是活性5化学发光测定法6第17页/共55页内毒素检测的参考值

10pg/ml以下：健康人值

10-20pg/ml：病变观察期大于20pg/ml：内毒素血症

肝炎败血症肿瘤内毒素浓度

50-32020-100020-700

第18页/共55页(1-3)--D-葡聚糖第19页/共55页侵袭性真菌感染的定义定义:

指致病性真菌侵犯皮下组织、黏膜、肌肉和内脏器官等所引起的真菌感染性疾病，危害性较大。条件致病性真菌念珠菌属曲霉属其他第20页/共55页侵袭性真菌感染的特点1.不产生内毒素和外毒素致病机理不明4.早期症状无特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死亡率高2.致病力一般较弱，机体免疫低下时发生3.感染菌种变化，白色念珠菌感染下降，曲霉菌感染增长趋势上升明显第21页/共55页1.内源性诱因2.外源性诱因影响机体抵抗力的各种疾病，如白血病、癌症、结核、肺脓肿、糖尿病、肝脏疾病以及维生素缺乏等广谱抗生素，抗肿瘤药物和免疫抑制剂；插管等侵袭性治疗，骨髓和实体器官移植；免疫缺陷综合症侵袭性真菌感染的诱因第22页/共55页侵袭性真菌感染（IFI）现状IFI诊断困难及漏诊情况严重IFI发生率不断增加IFI感染病死率很高123第23页/共55页国内侵袭性真菌感染不容忽视

刘正印等，中华医学杂志2003,83(5):399-402感染人数第24页/共55页国内侵袭性真菌感染不容忽视

临床药物治疗杂志2007年第5卷第1期感染率(%)第25页/共55页中国感染与化疗杂志2008年7月20日第8卷第4期第26页/共55页

尸检研究发现，75%的侵袭性真菌感染病例在生前漏诊

诊断困难的主要原因：

---临床表现不典型，易被基础疾病所掩盖

---确诊常需侵入性手段获得组织标本，侵入性操作常因患者的病情所限难以实施---真菌检测项目开展相对不足或滞后IFI诊断困难及漏诊情况严重第27页/共55页主要可引发侵袭性真菌感染的疾病肺炎肺纤维症脑出血脑梗塞硬膜下血瘤术后胸部大动脉瘤术后糖尿病再生障碍性贫血MODSDIC胃癌，肝癌，肝内胆管癌，肺癌，多发性骨髓瘤，白血病，恶性淋巴瘤肺结核腹腔内脓肿AIDS呼吸系统疾病感染症及寄生虫病循环系统疾病内分泌疾病血液及造血器官疾病肿瘤类第28页/共55页侵袭性真菌感染(invasivefungalinfection,IFI)的发病率逐年上升,其中又以侵袭性肺部真菌感染(invasivepulmonaryfungalinfection,IPFI)最常见,大约占50%～60%。未经及时治疗的肺部真菌感染患者的病死率可高达30%～80%

。

侵袭性肺部真菌感染第29页/共55页临床表现：缺乏特异性,多表现为发热、咳嗽、咳痰、咯血、胸闷、呼吸困难等。

现状：两高两低一快检测方法相对滞后,早期诊断和治疗仍存在困难,副作用小的新型抗真菌药物价格昂贵,导致病死率高。高院内感染率和病死率低临床和实验室诊断率患者病情恶化快

侵袭性肺部真菌感染第30页/共55页死亡率(%)诊断延迟时间(h)ICU诊断延迟时间与死亡率的关系1133303510152025303512h12-24h

24-48h48hMorrellMetal.AntimicrobAgentsChemother2005,49:3640–3645.第31页/共55页美国四大医疗中心做的一项回顾性研究死亡率(%)诊断延迟时间(d)GareyKWetal.ClinInfectDis2006,43:25–31.第32页/共55页b1,6葡聚糖

磷脂双分子层几丁质麦角固醇b1,3葡聚糖合成酶mannoproteinsβ1,3真菌细胞膜、壁结构羊毛固醇C－14去甲基化酶14位还原和7－8位异构酶角鲨烯环氧化酶第33页/共55页1-3-β-D-葡聚糖本质及特点真菌细胞壁成分，占50%以上1其他微生物、动物及人的细胞不含该成分2用于侵袭性真菌感染的早期诊断3第34页/共55页(1-3)-β-D-葡聚糖特性1.2.3.对热极为稳定，高压121℃并不能使其灭活。在念珠菌和曲霉菌细胞壁中含量较多，对G试验灵敏。当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理后，(1-3)-β-D-葡聚糖可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液中含量增高。当真菌在体内含量减少时，机体免疫系统可将其清除。在浅部真菌感染中，(1-3)-β-D-葡聚糖未被释放出来，故其在体液中的量不增高。第35页/共55页“G”试验缘何而来？1-3-β-D-葡聚糖可特异性激活鲎变形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故称G试验。（1-3）-D-GlucanLAL-RM(反应物)G因子活化G因子凝固酶原 凝固酶凝固蛋白原凝固蛋白（凝胶）试验反应机理图：第36页/共55页内毒素与β-葡聚糖的检测比较已知能与鲎试剂发生反应的物质有细菌内毒素和β-葡聚糖，但它们的反应曲线不一样。内毒素反应曲线为S型特征曲线，而β-葡聚糖反应曲线为经过0点的斜线。第37页/共55页

内毒素和β-葡聚糖与鲎试剂反应的特征曲线第38页/共55页观察期不确定，费时费力，特征性不明显并对医师的专业水平要求高辅助方法：临床表现，免疫学，病理学，影像学检查等用于实验室检测，已成为这一领域研究的热点3.PCR技术：真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查和真菌核酸检测对儿童及接受造血干细胞移植患者、ICU患者不适用2.GM试验：曲霉属半乳甘露聚糖抗原检测。判断是否曲霉属真菌感染耗时短，灵敏度高，特异性强，定量检测可判断感染严重程度1.G试验：通过检测(1-3)-β-D-葡聚糖的含量，判断是否有真菌感染非传统检查敏感性低，耗时长,培养阳性率低。培养结果是定性的，有些标本采集困难直接培养真菌法传统检查特点方法侵袭性真菌感染的临床检测方法对比第39页/共55页－D－葡聚糖的评价可检测多种致病真菌感染念珠菌，曲霉，肺孢子菌，镰刀菌，地霉，组织胞浆菌，毛孢子菌等不能检测隐球菌、接合菌（根霉、毛霉、根毛霉、犁头霉等）敏感性、特异性：90％左右对于念珠菌血症,G试验检测是首选检查

J.Clin.Microbiol.2008.46:1009–1013.

第40页/共55页BG值在IFI临床表现出现之前就已经高于正常值

Pazos等报道5例确诊IFI及3例临床诊断的IFI患者，发现BG值升高出现在发热、咳嗽、胸痛等症状和肺部HRCT检查发现以前。平均早于发热5d

早于呼吸道症状平均10.7d

JClinMicrobiol，2005，43(1)：299—305G试验检测评价第41页/共55页

Odabasi等对确诊为粒细胞缺乏人群进行为期3周每周2次采血检测及临床观察发现：BG值开始高于60pg／ml的时间比最后确诊为IFI或临床诊断IFI平均提前了10d

ClinInfectDis，2004，39(2)：199—205G试验检测评价第42页/共55页－D－葡聚糖参考值健康人：<10pg/ml

可疑感染：10~20pg/ml深部真菌感染：>20pg/ml第43页/共55页关于G试验建议G试验临床应用

1明确诊断（抗真菌药物治疗前）

2治疗效果监测（抗真菌药物治疗后）

3连续2次采血进行G试验第44页/共55页临床细菌内毒素及

(1-3)--D-Glucan检测的国内外发展国外：血液（包括血浆、脑脊液、血清、腹水液、尿液、唾液、乳汁等）中内毒素以及(1-3)--D-Glucan微量定量检测已经成为现实，目前在美国、日本等国均已出现专用细菌内毒素及(1-3)--D-Glucan检测仪器及配套的检测试剂盒，而且获得FDA及厚生省批准文号，作为一种日常检测项目。国内：MB-80检测系统，为国内独家研制和生产的检测临床内毒素及(1-3)--D-Glucan的专用仪器，同时具有配套的检测试剂盒

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获得SDA批准文号,第45页/共55页降钙素原第46页/共55页生化结构和生物合成1生物来源2降钙素原概述

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