遗传学实验单一

细胞与遗传实验杨玲细胞与遗传医学系实验室要求签到1穿白大衣2损坏公物要赔偿3保持实验室整洁干净、每次实验完毕安排值日生4细胞与遗传实验课要求每班分8组，以组形式完成系统性实验每次试验结束后完成并提交一份实验报告（每人）认真参与、完成实验思考、提问、建议、总结第1、2周活细胞观察、细胞传代培养、细胞计数第3、4周不同应激对细胞的影响及可能机制第5、6周文献阅读—提交一份论文翻译第7、8周凋亡相关基因－Bax表达产物的检测第9、10周微核检测、染色体标本的制备第11、12周遗传病致病基因（DNA）提取第13、14周遗传病致病基因检测（PCR法）实验安排（进度）细胞实验的整体性设计theprocessbywhich

cells

aregrownundercontrolledconditions,generallyoutsideoftheirnaturalenvironment.

取活体动物组织，在体外，无菌条件下，模拟体环境（营养、温度、pH值、气体），对其进行培养，使细胞能够生存、生长、保持原来生物学特性的一种实验方法。

细胞培养(Cellculture)细胞培养内容细胞原代培养(primarycellculture)细胞株(cellline)细胞换液、细胞传代培养细胞形态观察细胞计数细胞生长曲线、分裂指数、细胞活率细胞冻存与复苏等等

实验（一）实验内容活细胞观察(observationofcellmorphology)细胞传代培养(subculture)细胞计数(cellcounting)

无菌环境

仪器设备

普通器材

一般试剂实验室基本条件无菌环境

无菌室

无菌操作

back无菌室结构图洗手着装近火焰操作试剂瓶等斜放

back无菌操作超净工作台生物安全柜二氧化碳培养箱倒置显微镜低温冰箱back液氮罐

器材back试剂活细胞观察细胞传代培养细胞计数

实验（一）

体外培养的、生长中的细胞，借助显微镜来进行观察、比较、判断，从而决定细胞的进一步处理---换液、传代、准备进行指标的检测~~活细胞观察(observationofcellmorphology)倒置显微镜器材方法肉眼观察培养液清浊度培养液颜色显微镜下观察细胞的形状细胞的透明度细胞的密度异物生长Hela:宫颈癌细胞

MorphologyofCellsinCulture

Cellsinculturecanbedividedintothreebasiccategoriesbasedontheirshapeandappearance(morphology).Fibroblastic(orfibroblast-like)cellsarebipolarormultipolar,haveelongatedshapes,andgrowattachedtoasubstrate.

Epithelial-likecellsarepolygonalinshapewithmoreregulardimensions,andgrowattachedtoasubstrateindiscretepatches.

Lymphoblast-likecellsaresphericalinshapeandusuallygrowninsuspensionwithoutattachingtoasurface.宫颈癌HeLa细胞贴壁生长，呈多角形人肺腺癌细胞HAC-84细胞

贴壁，呈上皮样生长新生SD大鼠肺成纤维细胞（原代）：贴壁，呈梭形细胞呈圆形，边缘清晰整齐，贴壁生长单核巨噬细胞（未刺激状态）单核巨噬细胞（活化剂刺激6h后）细胞形态不规则，向四周伸展伪足，边缘不清，贴壁生长BackMolt4细胞--成人T淋巴细胞白血病细胞株细胞呈葡聚状生长，悬浮细胞，聚集呈团，如单个散开分布示状态不好细胞在支持物表面长满后，进行重新分配，再培养的过程。细胞传代培养(subculture)超净工作台二氧化碳培养箱倒置显微镜细胞株（Hela）滴管、培养瓶等培养液：10%小牛血清DMEM

消化液：0.25%胰蛋白酶液器材与试剂操作单层贴壁细胞——弃原培养液——加胰蛋白酶液(1min)——弃胰蛋白酶液

——静置2min30s——定量加入培养液3ml——吹打细胞成单细胞悬液——加新鲜培养液——

一分为二——继续培养

细胞传代消化法示意图显微镜下细胞消化前后示意图细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状

注意无菌操作胰蛋白酶消化时间要严格掌握(浓度、pH、温度)Back细胞的传代、冻存、生化研究及生长曲线制作等，都需对细胞进行计数。细胞的多少对实验结果会有影响。细胞计数(cellcounting)血球计数板普通光学显微镜器材0.25%胰蛋白酶液培养液试剂操作单层贴壁细胞——弃原培养液——加胰蛋白酶液(1min)——弃胰蛋白酶液

——静置2min30s——定量加入培养液3ml——吹打细胞成单细胞悬液——取一滴至血球计数板——

计数细胞

细胞数/毫升＝（４大格细胞数÷4）×104

1ml＝1000mm3计算公式细胞计数示意图每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3

细胞悬液要充分打匀正确使用计数板(不要压坏血盖片)悬液渗入计数室时，不易过多（溢出）、过少（气泡）数细胞有压线时，数左不数右、数上不数下正确使用显微镜（电源、亮度、倍数、聚光器等）注意小结

细胞传代单层贴壁细胞——弃原培养液——加胰蛋白酶液(1min)——弃胰蛋白酶液

——静置2min30s——定量加入培养液3ml——吹打细胞成单细胞悬液——加新鲜培养液——

一分为二——继续培养细胞计数单层贴壁细胞——弃原培养液——加胰蛋白酶液(1min)——弃胰蛋白酶液

——静置2min30s——定量加入培养液3ml——吹打细胞成单细胞悬液——取一滴至血球计数板——

计数细胞

活细胞观察（培养细胞瓶、皿或板放在倒置显微镜载物台上）——

进入无菌室——细胞传代培养（1传2）——取1滴细胞悬液

——显微镜下细胞计数小结具体操作单层贴壁细胞——弃原培养液——加胰蛋白酶液(1min)——弃胰蛋白酶液

——静置2min30s——定量加入培养液3ml——吹打细胞成单细胞悬液

——取一滴至血球计数板——

计