免疫检测技术的基本原理

关于免疫检测技术的基本原理第1页，共86页，2023年，2月20日，星期三第2页，共86页，2023年，2月20日，星期三免疫学检测技术的优点高度的灵敏性高度的特异性第3页，共86页，2023年，2月20日，星期三免疫分析技术的应用常用的诊断技术血凝试验酶联免疫吸附试验胶体金免疫技术放射免疫分析技术第4页，共86页，2023年，2月20日，星期三凝集试验概念：颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗体结合，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应。1.直接凝集反应抗原与抗体直接混合作用，出现凝集为阳性结果。①玻片直接凝集法：定性试验②试管直接凝集法：半定量试验第5页，共86页，2023年，2月20日，星期三试管法半定量试验+

玻片直接凝集试验1/21/41/81/161/321/641/1281/2561/512第6页，共86页，2023年，2月20日，星期三2.间接凝集法先将可溶性抗原或抗体吸附在颗粒载体上(如RBC,乳胶颗粒)，再与相应抗体或抗原反应，出现凝集为阳性结果。临床常用的有间接血凝试验、乳胶凝集试验等。+→待检样品抗原吸附血球或乳胶颗粒反应凝集物第7页，共86页，2023年，2月20日，星期三3.间接凝集抑制试验先将待检抗原与已知的抗体反应，再加入用已知抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。例：乳胶凝集抑制试验检测HCG(妊娠诊断)步骤1：将已知抗体与待检标本混匀＋＋步骤2：加入抗原吸附的乳胶颗粒混匀抗原吸附乳胶颗粒结果判断：不凝集为阳性结果已知抗体待检标本第8页，共86页，2023年，2月20日，星期三凝集反应第9页，共86页，2023年，2月20日，星期三2.沉淀反应

概念：可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物称沉淀反应。类型：★单向免疫扩散★免疫比浊法★双向免疫扩散★对流免疫电泳第10页，共86页，2023年，2月20日，星期三

单向琼脂扩散试验第11页，共86页，2023年，2月20日，星期三双向琼脂扩散试验第12页，共86页，2023年，2月20日，星期三

对流免疫电泳第13页，共86页，2023年，2月20日，星期三测吸光度计算抗原或抗体的含量抗体抗原免疫复合物的浓度与透射光的衰减呈正相关免疫比浊法原理第14页，共86页，2023年，2月20日，星期三3.中和反应如抗“O”试验4.免疫标记技术概念：用荧光素、酶、同位素等标记抗体或抗原用以测定相应抗原或抗体的技术称为免疫标记技术。常用方法有免疫荧光技术、酶免疫技术、放射免疫检测技术等。特点：敏感、特异、快速，能定性、定量、定位。第15页，共86页，2023年，2月20日，星期三免疫标记技术酶免疫标记技术荧光免疫分析技术放射免疫分析技术免疫金标记技术第16页，共86页，2023年，2月20日，星期三酶联免疫吸附试验1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)第17页，共86页，2023年，2月20日，星期三酶及其底物

酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物，将得到不同的颜色反应.第18页，共86页，2023年，2月20日，星期三酶底物显色反应

测定波长

辣根过氧化物酶邻苯二胺

四甲替联苯胺

氨基水杨酸

邻联苯甲胺

2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐

橘红色

黄色

棕色

兰色

蓝绿色492460449

425

642

碱性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸盐(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色

红色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色

深蓝色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光

黄色

360,450

420

第19页，共86页，2023年，2月20日，星期三2、标记方法戊二醛交联法过碘酸盐氧化法第20页，共86页，2023年，2月20日，星期三戊二醛交联法(一步法）抗体-NH2+COH-（CH2）3-COH+NH2-酶抗体-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶抗体-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-抗体酶-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶第21页，共86页，2023年，2月20日，星期三戊二醛交联法（二步法）COH-（CH2）3-COH+NH2-酶抗体-NH2+CHO-（CH2）3-CH=NH2-酶抗体-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶第22页，共86页，2023年，2月20日，星期三过碘酸盐氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2抗体OOONN抗体抗体H2ON抗体NaBH4Schiff碱酶-五炭糖环第23页，共86页，2023年，2月20日，星期三标记免疫物的分离与鉴定1、分离目的：去除游离酶方法：盐析、柱层析2、鉴定抗体活性酶活性标记物纯度第24页，共86页，2023年，2月20日，星期三ELISA的种类和变化

（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法（四）双位点一步法（五）捕获法测IgM抗体（六）应用亲和素和生物素的ELISA

第25页，共86页，2023年，2月20日，星期三第26页，共86页，2023年，2月20日，星期三（一）双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原第27页，共86页，2023年，2月20日，星期三获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体洗涤除去未结合的抗体及杂质加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本（抗原）形成固相抗体－抗原复合物洗涤除去其他未结合的物质加酶标抗体生成抗体—待测抗原—酶标记抗体的复合物彻底洗涤未结合的酶标抗体加底物进行酶催化反应根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定第28页，共86页，2023年，2月20日，星期三

间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。（二）间接法第29页，共86页，2023年，2月20日，星期三酶联免疫吸附试验(ELISA-间接法)第30页，共86页，2023年，2月20日，星期三包被固相载体:用已知抗原包被固相载体加待检标本:使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质加酶标抗抗体:与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体加底物显色根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定第31页，共86页，2023年，2月20日，星期三（三）竞争法

此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。第32页，共86页，2023年，2月20日，星期三用已知特异性抗体包被固相载体测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合分别洗涤除去未结合的成分加底物显色分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比，计算标本中待测抗原含量第33页，共86页，2023年，2月20日，星期三对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。第34页，共86页，2023年，2月20日，星期三饲料中盐酸克伦特罗的测定饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，简曲霉毒素）饲料中有害微生物的快速筛检（如沙门氏菌）甲胺磷残留分析甲基对硫磷残留分析呋喃丹残留分析ELISA在饲料安全检测中的应用ELISA用于农药残留的检测第35页，共86页，2023年，2月20日，星期三河豚毒素

植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素苯并芘

主要有除草剂与杀虫剂两大类例如杀暝松（FN）、甲氟磷酸异已酶（SOMAN）、草不绿（Alachor）、西维因（Carbaryl）、多菌灵及克菌丹（Captan）等。农药的检测：第36页，共86页，2023年，2月20日，星期三食源性病原菌检测试剂盒大肠杆菌检测沙门氏菌检测单增李斯特菌金黄色葡萄球菌

第37页，共86页，2023年，2月20日，星期三转基因成份的检测：如转基因玉米中中的cry9e蛋白转基因大豆中的CP4EPSPS蛋白质．肉制品的掺假检测：以辣根过氧化物酶标记不同动物肌肉和血清球蛋A抗血清检查牛肉、马肉、猪肉、羊肉和驼肉检测14种畜禽熟肉制品，包括牛肉、羊肉、鹿肉和马肉等，在掺假率为1%时即可检出食品其他检测：第38页，共86页，2023年，2月20日，星期三荧光抗体技术的原理与方法

用荧光素标记抗原或抗体，再与标本中抗体或抗原反应，然后在荧光显微镜下观察，形成的IC可散发出荧光，对标本中的抗原或抗体进行测定和定位。常用的荧光素异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)等。常用的方法直接荧光法间接荧光法第39页，共86页，2023年，2月20日，星期三免疫荧光技术第40页，共86页，2023年，2月20日，星期三免疫荧光技术——直接法Ag荧光素标记的特异性抗体组织切片第41页，共86页，2023年，2月20日，星期三免疫荧光技术——间接法Ag荧光素标记的抗抗体组织切片待测抗体第42页，共86页，2023年，2月20日，星期三免疫荧光技术第43页，共86页，2023年，2月20日，星期三荧光显微镜第44页，共86页，2023年，2月20日，星期三荧光显微镜使用原理激发滤片（BG）吸收滤片（OG）标本FITC吸收光峰值：490-495nmFITC发射光峰值：520-530nmBG：325-500OG：410-650第45页，共86页，2023年，2月20日，星期三免疫金标记技术免疫金标记技术(Immunogoldlabellingtechique)

主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（immunogoldsilverstaining，IGSS）。第46页，共86页，2023年，2月20日，星期三一、胶体金制备

胶体金（colloidalgold）的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（goldsolution）。第47页，共86页，2023年，2月20日，星期三

胶体金的制备及特性胶体金粒径1%柠檬酸钠加入量胶体金特性（nm)（ml)*呈色lmax(nm)162.00橙色51824.51.50橙红色522411.00红色52571.50.70紫色535*还原100ml0.01%HAuCl4所需量第48页，共86页，2023年，2月20日，星期三胶体金（ColloidalGold）

15~60nm优质劣质第49页，共86页，2023年，2月20日，星期三胶体金结合物（Conjugate）第50页，共86页，2023年，2月20日，星期三一、免疫渗滤测定(IFA)第51页，共86页，2023年，2月20日，星期三

斑点渗漏法

其原理与层析法相类同，中心圆点为一株单抗，边上小点为抗鼠二抗。先将待测样品滴在其中，若有抗原即被结合在中心圆点，洗去未结合抗原，再滴加金标另一株单抗，若有抗原则形成金-Ab-Ag•薄膜的红色斑点，而边上是金-Ab-Ab2•薄膜的质控点，是为金标二步法。

第52页，共86页，2023年，2月20日，星期三IFA——双抗体夹心法测抗原AB第53页，共86页，2023年，2月20日，星期三IFA——结果判断第54页，共86页，2023年，2月20日，星期三二、免疫层析测定（ICA）第55页，共86页，2023年，2月20日，星期三层析法将金标的一株单抗吸附于下端的玻璃纤维纸上，浸入尿液，此金标单抗即被溶解，并随尿液上行，若尿中有相应抗原，既形成Ag-Ab-金复合物，当上行至中段醋酸纤维薄膜，即与下端的另一株单抗结合并被固定下来，显示阳性结果。其上方还有一条抗鼠二抗，待红色金标单抗上行此处即被固定下来，作为金标单抗质控的提示。此种方法称金标一步法。第56页，共86页，2023年，2月20日，星期三

兔抗鼠IgG鼠抗HCG单抗金标鼠抗HCG单抗尿液浸湿标志线手持端斑点金免疫层析试验（一）第57页，共86页，2023年，2月20日，星期三斑点金免疫层析试验（二）尿样阳性弱阳性阴性无效质控线测试线第58页，共86页，2023年，2月20日，星期三

ICA——双抗体夹心法测抗原第59页，共86页，2023年，2月20日，星期三ICA---竞争法测抗原免疫层析试验竞争法测小分子抗原原理图第60页，共86页，2023年，2月20日，星期三ICA竟争法结果观察

阴性阳性无效第61页，共86页，2023年，2月20日，星期三ICA——间接法测抗体第62页，共86页，2023年，2月20日，星期三ICA结果观察

阳性阴性无效第63页，共86页，2023年，2月20日，星期三IFA与ICA的比较IFAICA试剂形式渗滤装置及附加试剂试剂条试剂保存4~8℃6个月室温一年操作步骤3~51观察时间3min3~20min阳性反应颜色浓度操作结束颜色不变颜色逐渐加深第64页，共86页，2023年，2月20日，星期三IFA穿流（FLOWTHROUGH）ICA横流（LATERALFLOW）第65页，共86页，2023年，2月20日，星期三1、罗立新,缪珑,潘力,等.快速检测产单核李斯特菌免疫胶体金层析法的研究[J].中国卫生检验杂志,2006,16(2):154-156.2、赖卫华,熊勇华,陈高明,等.应用胶体金试纸条快速检测赭曲霉毒素A的研究[J].食品科学,2005,26(5):204-207.第66页，共86页，2023年，2月20日，星期三3、谌志强,段惠莉,王新为,等.大肠埃希菌O157:H7的胶体金免疫渗滤法检测[J].中国公共卫生,2005,21(4):705-706.4、谢昭聪,宋志强,吕敬章,等.应用胶体金免疫层析法检测水产品中霍乱弧菌的研究[J].中国国境卫生检疫杂志,2005,28(3):163-165.第67页，共86页，2023年，2月20日，星期三5、王中民,李君文,王新为,等.免疫金渗滤试验检测食品中沙门氏菌的研究[J].微生物学免疫学进展,2001,29(4):45-47.6、刘永德,汪毅,陈禹雷,免疫金探针快速检测禽流感病毒研究[J].上海交通大学学报:农业科学版,2005,23(3):321-324.第68页，共86页，2023年，2月20日，星期三斑点金免疫渗滤试验ADCB阴性（未怀孕）阳性（怀孕）加尿样除去滤器加胶体金标记抗体加洗涤液结果判定第69页，共86页，2023年，2月20日，星期三免疫印迹法图解SDS裂解病毒聚丙酰胺凝胶电泳-+95684512KD电转印至NC膜上置待测血清中，漂洗；加酶标抗抗体，漂洗；加底物显色1204124KD第70页，共86页，2023年，2月20日，星期三

第四节放射性核素标记技术一、常用标记方法二、标记免疫物的分离与纯化第71页，共86页，2023年，2月20日，星期三R：放射性核素示踪高灵敏不直接探测待测物，而探测待测物上的标记信号(标记物的放大效应)I：免疫学反应高特异废除以往沿用的无机或有机试剂，代之以抗体为结合剂第72页，共86页，2023年，2月20日，星期三常用标记方法1、常用放射性核素2、125I的标记方法直接法（氯胺T法）间接法（连接法）第73页，共86页，2023年，2月20日，星期三直接法（氯胺T法）OH-NHCHONH-CH2OH-NHCHONH-CH2Na125I4。C125I氯胺T第74页，共86页，2023年，2月20日，星期三间接法（连接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2HOO=C-C-CH2CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2HOO=C-C-CH2+Na125I氯胺T125INSHPP第75页，共86页，2023年，2月20日，星期三间接法（连接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2