毕业论文-甘蔗胚性细胞团诱导与增殖的相关因子研究

甘蔗糖业SugarcaneandCanesugar：TITLE甘蔗胚性细胞团诱导与增殖的相关因子研究NUM甘蔗胚性细胞团诱导与增殖的相关因子研究摘要：以甘蔗ROC22愈伤组织为材料，研究相关因子对甘蔗胚性细胞团诱导与增殖的效应。结果表明：2,4-D3.0mg/L较利于胚性细胞团的诱导，诱导率为30.33%；KT0.5mg/L对胚性细胞团的继代增殖较佳，培养25天后的增殖倍数为38.8倍；培养日龄为15天和第4代的胚性细胞团增殖倍数较高，分别为42.06倍和44.33倍；先暗培养再光照培养对胚性细胞团的继代增殖较好，培养25天后的增殖倍数为35.05倍。关键词：甘蔗；组织培养；胚性细胞团；相关因子StudyofRelatedFactorsontheInductionandProliferationofEmbryogenicCellClustersinSugarcaneAbstract:ThecallusofsugarcanevarietyROC22wasusedasthematerialstostudyrelatedfactorsontheinductionandproliferationofembryogeniccellclusters.Theresultsindicatedthatitwasbettertoinduceembryogeniccellclusterswith2,4-D(3.0mg/L),andtheinductionratewas30.33%.ItwasbettertosubcultureembryogeniccellclusterswithKT(0.5mg/L),andtheproliferationtimeswas38.8afterculturefor25days.Theproliferationtimewashigherwhentheageofembryogeniccellclusterswas15daysor4thsuccessivetransfer,whichwas42.06timesand44.33timesrespectively.Itwasbettertosubcultureembryogeniccellclusterswhenfirstdarkcultivationtoilluminationcultivation,andtheproliferationtimewas35.05afterculturefor25days.Keywords:Sugarcane;Tissueculture;Embryogeniccellclusters;Relatedfactors1前言甘蔗(Saccharumofficinarum)为禾本科甘蔗属，原产于热带和亚热带地区，是我国最重要的糖料经济作物之一。甘蔗种植面积占糖料种植面积的85%以上，产糖量占全国总产糖量的90%以上。广西是我国甘蔗种植面积最大之一的省份[1-2]。ROC22是广西目前种植的当家品种，具有高产高糖、易脱叶、抗性好的特性，深受蔗农喜欢。然而，甘蔗因常年连种而使品种退化，导致品质下降，产量降低。许多学者利用组培快繁技术，已通过以芽增芽、愈伤组织分化不定芽等途径进行了大量研究，但未曾对甘蔗胚性细胞团的诱导和增殖的相关因子进行系统的研究。胚性细胞团在愈伤组织的基础上产生，具有增殖快、分化率高、成苗率高等优点[3-4]。本研究以ROC22愈伤组织为材料，研究相关因子对甘蔗胚性细胞团诱导与增殖的效应，为今后进一步研究甘蔗诱变突变体和遗传转化等提供参考依据。2材料与方法2.1试验材料以甘蔗ROC22愈伤组织为供试材料，来自广西大学农学院植物组织培养中心本课题组。2.2试验方法2.2.1不同2,4-D浓度对甘蔗胚性细胞团诱导的比较试验以MS＋NAA0.2mg/L＋KT0.5mg/L为诱导培养基，分别添加2,4-D0mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L，每处理30瓶，每瓶10粒黄豆大的愈伤组织，重复3次，培养25天后统计胚性细胞团诱导率，比较不同浓度2,4-D对甘蔗胚性细胞团诱导的影响。2.2.2不同细胞分裂素对甘蔗胚性细胞团继代增殖的比较试验以MS＋2,4-D3.0mg/L＋NAA0.2mg/L为继代培养基，添加不同种类和浓度KT(0.5mg/L，1.0mg/L)、CPPU(0.5mg/L，1.0mg/L)、TDZ(0.02mg/L，0.04mg/L)，比较不同细胞分裂素对甘蔗胚性细胞团继代增殖的影响。2.2.3不同培养日龄对甘蔗胚性细胞团继代增殖的比较试验以MS＋2,4-D3.0mg/L＋NAA0.2mg/L＋KT0.5mg/L为继代培养基，比较不同培养日龄(15天，25天，35天，45天)的胚性细胞团对继代增殖的影响。2.2.4不同继代代数对甘蔗胚性细胞团无性系增殖的比较试验以MS＋2,4-D3.0mg/L＋NAA0.2mg/L＋KT0.5mg/L为继代培养基，比较不同继代代数(1～10代)的胚性细胞团继代增殖的差异。2.2.5不同光照培养方式对甘蔗胚性细胞团继代增殖的比较试验以MS＋2,4-D2.0mg/L＋NAA0.2mg/L＋KT0.5mg/L为继代培养基，比较不同光照培养方式(全光照，先光后暗，全暗培养，先暗后光)对甘蔗胚性细胞团继代增殖的影响。以上培养基均为附加蔗糖30g/L，琼脂6g/L，pH5.8；培养光强为1500～1800lx，培养温度为25～28℃。甘蔗胚性细胞团的继代增殖倍数用称重法(鲜重)比较，在继代接种时和培养25天后分别进行。相关指标的计算公式如下：胚性细胞团诱导率(%)＝发生胚性细胞团块数/愈伤组织接种块数×100胚性细胞团增殖倍数＝培养后胚性细胞团重量(g)/接种时胚性细胞团重量(g)2.2.6统计分析试验数据用SPSS方差分析软件进行统计分析。3结果与分析3.1不同2,4-D浓度对甘蔗胚性细胞团的诱导效应从表1可以看出，随着2,4-D浓度的变化，甘蔗胚性细胞团的诱导率呈现一定的规律。从处理A1～A5，即2,4-D浓度范围为0～4.0mg/L，甘蔗胚性细胞团的诱导率呈低高低的趋势，每个处理的诱导率差异均达到极显著水平，说明甘蔗胚性细胞团诱导受2,4-D浓度影响很大，适宜的2,4-D浓度有利于形成胚性细胞团，但2,4-D浓度过高则会抑制。其中，处理A4，即2,4-D浓度为3.0mg/L，对甘蔗胚性细胞团诱导率最高，为30.33%，由此说明，2,4-D浓度为3.0mg/L时，对甘蔗胚性细胞团的诱导效应最佳。表1不同2,4-D浓度对甘蔗胚性细胞团的诱导效应处理代号2,4-D浓度(mg/L)愈伤组织接种块数(块)胚性细胞团发生块数(块)胚性细胞团诱导率(%)A10.030000.00EeA21.0300299.67DdA32.03005819.33CcA43.03009130.33AaA54.03007926.33Bb注：同一列数据中不同的字母表示差异显著(0.01＜P＜0.05)。下同。3.2不同细胞分裂素对甘蔗胚性细胞团继代增殖的影响由表2可以看出，不同种类和浓度的细胞分裂素对甘蔗胚性细胞团的继代增殖影响不同。与对照(CK)相比，分别添加一定浓度的KT、CPPU、TDZ等3种细胞分裂素，均可以提高胚性细胞团的增殖率。其中，添加KT、TDZ的处理对胚性细胞团的增殖效应比CPPU的好；以KT0.5mg/L(B5处理)对甘蔗胚性细胞团继代增殖最好，培养25天后其增殖倍数达38.80倍，且与其他处理之间差异达极显著；其次是TDZ0.02mg/L，胚性细胞团增殖倍数为36.11倍；再次是KT1.0mg/L,胚性细胞团增殖倍数为30.23倍。由此说明，在继代培养基中添加适宜浓度的激动素KT，更有利于甘蔗胚性细胞团的增殖。3.3不同培养日龄对甘蔗胚性细胞团继代增殖的影响表2不同细胞分裂素种类及浓度对甘蔗胚性细胞团继代增殖的影响处理代号细胞分裂素种类及浓度(mg/L)胚性细胞团接种时重量(g)胚性细胞团培养后重量(g)胚性细胞团增殖倍数胚性细胞团质量B1(CK)00.525.8311.22Gg+B2KT0.50.5521.3438.80Aa+++B3KT1.00.5817.5330.23Cc++B4CPPU0.50.549.7818.11Ff++B5CPPU1.00.6012.9421.56Ee++B6TDZ0.020.5921.3036.11Bb+++B7TDZ0.040.6118.1229.70Dd++注：+++表示最好；++表示较好；+表示一般。下同表3不同培养日龄的甘蔗胚性细胞团对继代增殖的影响处理代号胚性细胞团日龄(天)胚性细胞团接种时重量(g)胚性细胞团培养后重量(g)胚性细胞团增殖倍数胚性细胞团质量C1150.6025.2442.06Aa+++C2250.6224.1338.92Bb++C3350.6421.4633.53Cc++C4450.6519.5030.00Dd+从表3可以看出，不同培养日龄对甘蔗胚性细胞团继代增殖的影响不同。在15～45天范围内，随着日龄的增长，胚性细胞团的增殖降低。其中，培养日龄为15天的胚性细胞团(C1处理)增殖效果最好，增殖倍数达42.06倍，与其他处理之间的差异性均达极显著；甘蔗胚性细胞团增殖倍数的大小排序和胚性细胞团质量的优劣排序均为15天＞25天＞35天＞45天。试验结果表明，适宜的培养日龄有利于甘蔗胚性细胞团的继代增殖。3.4不同继代代数对甘蔗胚性细胞团无性系增殖的影响从表4可以看出，不同继代代数对甘蔗胚性细表4不同继代代数对甘蔗胚性细胞团无性系增殖的影响处理代号继代代数胚性细胞团接种时重量(g)胚性细胞团培养后重量(g)胚性细胞团增殖倍数胚性细胞团质量D110.6015.7326.22Gg+++D220.5618.0532.23Ee+++D330.5823.9741.33Bb+++D440.6127.3344.80Aa+++D550.6023.4139.01Cc++D660.6322.8236.22Dd++D770.6518.9229.11Ff++D880.6214.8824.00Hh++D990.5712.4821.89Ii++D10100.5911.0218.67Jj+胞团无性系增殖的影响不同。从第1～10代，胚性细胞团增殖倍数呈现低高低的规律。其中，以第4代的胚性细胞团(D4处理)增殖达到最高峰值，增殖倍数为44.80倍，与其他处理之间差异均达极显著。而到第10代的胚性细胞团(D6处理)增殖降到最低峰值，增殖倍数仅为18.67倍。从胚性细胞团的质量比较来看，以第1代至第4代的胚性细胞团质量为好。试验结果表明，适宜的继代代数有利于甘蔗胚性细胞团的继代增殖，而继代代数过高则不利于增殖。3.5不同光照培养方式对甘蔗胚性细胞团继代增殖的影响由表5可以看出，不同光照培养方式对甘蔗胚性细胞团继代增殖的影响不同。其中，先暗培养再光照培养对胚性细胞团的增殖效果最佳，增殖倍数为35.05倍，与其他处理之间的差异达到极显著水平。全光照培养的胚性细胞团增殖最少，增殖倍数仅为18.17倍。对胚性细胞团质量好的比较排序为：先暗后光＞全暗培养≥先光后暗＞全光照。试验结果表明，先暗培养再光照培养更有利于甘蔗胚性细胞团的继代增殖。4结论与讨论表5不同光照培养方式对甘蔗胚性细胞团继代增殖的影响处理代号培养方式光照时间(h/天)胚性细胞团接种时重量(g)胚性细胞团培养后重量(g)胚性细胞团增殖倍数胚性细团质量E1全光照240.6211.2718.17Dd+E2先光后暗120.6013.8023.00Cc++E3全暗培养00.6316.6626.45Bb++E4先暗后光120.6522.7835.05Aa+++4.1外源激素是影响甘蔗胚性细胞团诱导和增殖的重要因子在植物组织培养中，植物激素对愈伤组织和胚性细胞团的诱导起到关键作用。不同植物种类、不同诱导材料需要的外源激素种类和浓度均不同。其中，2,4-D是诱导甘蔗愈伤组织的不可缺少的重要因子[5]。本实验在此基础上对甘蔗ROC22胚性细胞团进行诱导，结果发现，未添加生长素2,4-D的培养基不能诱导出胚性细胞团，而添加一定浓度的2,4-D则能够诱导出胚性细胞团，并呈现一定的规律，以2,4-D浓度为3.0mg/L较利于甘蔗胚性细胞团的诱导，这与韩光禧等的研究结果相符[6]。添加一定浓度的细胞分裂素可以促进柑桔胚性细胞团的增殖[7]。本研究结果发现，在有2,4-D和NAA的继代培养基上，适当添加KT和TDZ均能显著提高甘蔗胚性细胞团的增殖效果，其中，以KT0.5mg/L最佳，胚性细胞团增殖倍数达38.80倍。由此证明，适当的生长素和细胞分裂素配比，更有利于甘蔗胚性细胞团的诱导和增殖。4.2材料的年龄和继代数影响甘蔗胚性细胞团的增殖胚性细胞团具有很高的繁殖能力和相应的增殖高峰，如玉米胚性细胞团的增殖高峰一般出现在转接培养后的15～20d内，培养20天后增殖降低，25天后停止增长，开始出现老化[8]。本研究结果表明，培养15天日龄的甘蔗胚性细胞团增殖能力最高，增殖倍数高达42.06倍，而在15天日龄以后的胚性细胞团，其增殖则逐渐下降，这一趋势与前人的有关研究相似，但甘蔗胚性细胞团增殖高峰和下降时间出现更早。因此，为防止胚性细胞团老化，应及时转接到新的培养基上继续培养。植物细胞离体培养的再生能力与培养的时间长短或代数高低密切相关。本研究结果发现，甘蔗胚性细胞团的增殖能力受继代代数影响很大，以第4代的继代增殖倍数最高，高达44.80倍，之后的代数则逐渐降低，这与薛美凤等对棉花的有关研究结果相符[9]。长期的继代不但降低胚性细胞团的增殖能力和分化能力，而且还会使胚发生畸形和再生植株不育。因此，甘蔗胚性细胞团不宜长期的继代；就与初代甘蔗胚性细胞团继代能力比较而言，一般不宜超过7～8代。4.3光照培养方式是影响甘蔗胚性细胞团增殖的重要培养条件对于愈伤组织来说，黑暗可以刺激其形成，而光照不利于其生长[10]。黄学林等在龙眼愈伤组织研究中发现光照使外植体褐化加重，且降低愈伤组织的诱导率或无法形成胚性愈伤组织[11]。本研究结果表明，先暗培养再光照培养方式对甘蔗胚性细胞团增殖最佳，培养25天后增殖倍数高达35.05倍，