W免疫学常用实验方法

（优选）W免疫学(Xue)常用实验方法第一页，共五十六页。非共价键结(Jie)合I.Antigen-AntibodyReaction抗体的互补决定区(CDRs)抗原决定簇(antigenicdeterminant)又称表位(epitope)非共价键结合第二页，共五十六页。CDR1CDR2CDR3CDR1CDR2CDR3CDR:ComplementarityDeterminingRegionFR:FrameworkRegionFR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4HLComplementarity-determiningregions(CDRs):

第三页，共五十六页。AntigenicDeterminant第四页，共五十六页。Specificity特(Te)异性

FeaturesofAg-AbReaction第五页，共五十六页。Reversibility可(Ke)逆性

Ag+Ab→Ag·Ab

解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。在一定条件下(如低pH、高浓度盐等)可以解离。第六页，共五十六页。Ratio最适(Shi)比例第七页，共五十六页。Sensitivity敏(Min)感性化学比色法：mg/ml酶反应测定法：5-10μg/ml(免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿)标记的免疫测定法：ng/ml水平(例如，用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml)

第八页，共五十六页。ELISA------酶联免疫吸附(Fu)试验Immunohistochemistry--------免疫组织化学FACS------流式细胞术WesternBlotting-------免疫印迹技术Oftenusedmethods第九页，共五十六页。1.ELISA(酶联免疫吸附(Fu)试验EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay)RIA(radioimmunoassay,Berson&Yalow，1960)IRMA(immunoradiovelricassay,Miles&Hiles,1968)E(L)I(S)A(Engvall&Perlmann,vanWeemenandSchuurs,1971)第十页，共五十六页。Copyright©2005AmericanAssociationforClinicalChemistryLequin,R.M.ClinChem2005;51:2415-2418Estimatesofthenumberofarticlespublishedper5-yearperiodfrom1960to2005Figure.Estimatesofthenumberofarticlespublishedper5-yearperiodfrom1960to2005.ThesearchwasdoneinFebruary2005inPubMed/NationalLibraryofMedicine,NIH,withthesearchterms:enzyme-immunoassay,enzyme-linkedimmunosorbentassay(EIA/ELISAcombined),andRIA.(Ordinate),numberofarticlesinwhichthekeywordsarequoted.(Abscissa),5-yearperiodsfrom1960to2005.

,combinedEIA/ELISA;

,RIA.[Note:Idonotpretendthatthenumbersinthisfigureareprecise;thetrends,however,areevident.]

第十一页，共五十六页。基础:抗(Kang)原或抗(Kang)体的固相化抗原或抗体的酶标记用途：目标蛋白的定性或定量分析

三个必要试剂：（1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）;（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。

ELISA第十二页，共五十六页。a.包(Bao)被b.抗原抗体反应c.酶促反应,显色d.终止显色，读取数据。ELISA基本的实验过程对照和标准曲线阳性对照阴性对照定量测定：标准品制作标准曲线待测样品的合理稀释第十三页，共五十六页。不同类型(Xing)的检测方法第十四页，共五十六页。第十五页，共五十六页。2.Immunohistochemistry(免疫组(Zu)化)原理：抗原抗体反应，抗体标记技术（荧光、酶）用途：组织或细胞内抗原的定性和定位流程：第十六页，共五十六页。Copyright©2007AmericanAssociationforCancerResearchZhao,X.etal.CancerRes2007;67:4443-4450Figure3.mTNFinducesinfiltrationofinnateimmunecellsandangiostasisintumorsfromTNFR1–/–butnotTNFR1–/–/R2–/–mice.AtoF,TNFR1–/–miceorTNFR1–/–/R2–/–micewereinjecteds.c.with5x106ofJ-mTNF10cells.Tendaysaftertumorcellchallenge,tissuesectionsoftheinjectionsitewerestainedforMac-1+(AandB),Gr-1+(CandD),andCD31+(EandF)cellsasindicated.GandH,forconfocalmicroscopyanalysis,tissuesectionswerestainedwithCy3-labeledanti-CD31forbloodvesselendothelialcells(green)andtheVasoTACSinsitukittodetectapoptosis(red).Arrows,apoptoticendothelialcellsinthetumor.第十七页，共五十六页。成败的关键因素：组织的固定、包埋(Mai)抗体（特异性、浓度、孵育温度和时间）非特异性抗原的封闭内源性酶或自发荧光的消减显色思考：为什么有的抗体能用于冰冻切片却不能用于石蜡切片？第十八页，共五十六页。3.FlowCytometricanalysis(流(Liu)式细胞术)FACS:(Fluorescence-ActivatedCellSorter)BDFACSVantageBD-Calibur第十九页，共五十六页。测量(Liang)对象

大小悬浮在溶液中的相互离散颗粒大小范围：0.2μm-300μm

高等真核细胞类型酵母细胞类型细菌 多细胞的聚集体，如胰岛等。细胞核非生命颗粒染色体其它细胞器以及乳化微球等。

第二十页，共五十六页。细胞表型分析胞内细胞因子的检测细胞周期(Qi)和DNA倍体分析细胞分选主要用途第二十一页，共五十六页。（1）多参数定(Ding)量分析每一个细胞；

（2）细胞分选；高纯度：99%以上；可分析小于1/10000比例的稀有细胞群、单细胞克隆等。

(3）高通量（分析分选）．分析150，000个/秒分选100，000个/秒

特点第二十二页，共五十六页。

基本(Ben)结构第二十三页，共五十六页。工作原(Yuan)理第二十四页，共五十六页。二色镜

123带通滤波片光电倍增管激光束细胞收集透镜前向散射光侧向散射光，荧光a.光信号(Hao)收集分离，导向，各探测通道接收并转化为电信号(Hao)。第二十五页，共五十六页。FSCSSCFL1FL2FL3对(Dui)数

线性线性

线性

对数脉冲处理，模数转换光信号电信号记录数据，显示结果b.数据处理第二十六页，共五十六页。c.细(Xi)胞分选488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector第二十七页，共五十六页。外周(Zhou)全血细胞散射光双参数点图

（红细胞溶解后）颗粒度细胞大小流式细胞仪数据分析非荧光信号第二十八页，共五十六页。直方图分(Fen)析荧光信号第二十九页，共五十六页。点状图分(Fen)析第三十页，共五十六页。设(She)门分析

可以通过设“门”(Gate)，分析、分选感兴趣的细胞。第三十一页，共五十六页。

实验对照(Zhao)的设计

阴性对照：常用同型抗体对照阳性对照：单阳性对照（多色分析时用于仪器校正）

抗体的选择

首选直标抗体荧光分子

实验标本的处理

单细胞悬液的制备抗体浓度非特异结合的去除：洗涤和封闭

第三十二页，共五十六页。4.WesternBlott第三十三页，共五十六页。5.HybridomaTechnique&MonoclonalAntibodyPreparationJerme，KöhlerandMilstein1984NobelPrizeBcellMyelomaSecreteAbClonalAclonalcelllinesecretingspecificAb?第三十四页，共五十六页。BcellMyelomaFusionBcellBcell+BcellBcell+MyelomaMyelomaMyeloma+Myelomaalive第三十五页，共五十六页。Bcell+MyelomaMyelomaMyeloma+MyelomaDNAA(氨基喋呤)HGPRT+，TK+

H,次黄嘌呤

T,胸腺嘧啶HGPRT-，TK-DieHGPRT-，TK-

H,次黄嘌呤

T,胸腺嘧啶AclonalcelllinesecretingspecificAb---HybridomaHGPRT次嘌呤鸟嘌呤磷酸核(He)糖转移酶(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)TK胸腺嘧啶激酶(Thymidinekinase)第三十六页，共五十六页。第三十七页，共五十六页。PreparingmAbsfrommurineascitesPristane(i.p.)Hybridoma(i.p.)ascitesMonoclonalantibodyELISA第三十八页，共五十六页。II.AssayforcellfunctionProliferation:Tcell,tumorcell,…Cytotoxicassay:Tcell,NKcell,…第三十九页，共五十六页。CellProliferationStimulatorsNonspecific:Mitogen:LPS,ConA,PHASuperantigen(超抗原):SEBCytokine:IL2,IL4,TNFAntibody:CD3,TCR,CD28Specific:specificantigen:破伤风类毒素(Su)，PPD(纯结核蛋白衍生物)MHC:同种异体细胞(MLR,混合淋巴细胞培养)第四十页，共五十六页。AssayforTcellproliferation3H-TdRwashStimulateAssaya.3H-TdR第四十一页，共五十六页。b.MTTAssayMechanism:

操作简单，重复(Fu)性差第四十二页，共五十六页。c.CFSEFigure15.67FollowingcellproliferationinhumanperipheralbloodlymphocytesusingtheCellTraceCFSECellProliferationKitC34554).HumanperipheralbloodlymphocyteswereharvestedandstainedwithCellTraceCFSE(carboxyfluoresceindiacetate,succinimidylester;5(6)-CFDA,SE)onDay0.AportionofthepopulationwasarrestedattheparentgenerationusingmitomycinC(redpeak).Theremainderofthesamplewasstimulatedwithphytohemagglutininandallowedtoproliferatefor5days.Solidgreenpeaksrepresentsuccessivegenerations./handbook/figures/2018.html

CELLproliferation第四十三页，共五十六页。AssayforTcellcytotoxicityTargetcell51CrlabeledTargetcellCTLTargetcellCr51releaseAssayCTL51Crrelease第四十四页，共五十六页。Isolationofstemcells密度梯(Ti)度离心法单抗贴壁铺展法免疫磁珠分选流式细胞分选法III.Technologyinvolvedinstemcellresearch第四十五页，共五十六页。IndentificationofstemcellsFACS：造血干细胞可鉴(Jian)定如下marker—CD34，CD33，Sca-1，c-Kit显微镜技术：生长形态，核型人类骨髓干细胞体内分化：胚胎干细胞在裸鼠体内生长分化，形成包含三个胚层来源的良性畸胎瘤基因芯片：分析基因表达差异第四十六页，共五十六页。Cultureo