2023年植物组织培养复习笔记

植物组织培养复习资料绪论ﻩ

一、概念:植物组织培养：在无菌条件下,将离体的植物器官，组织，细胞以及原生质体，培养在人工培养基上和人工控制的环境中,使其生长，分化，增殖，甚至长出新的植株的过程和技术。ﻫ外植体：在无菌条件下，离体培养于人工培养基上的，用于达成某种培养目的的原始植物材料。ﻫ培养基:根据植物营养原理和植物组织离体培养的规定而人工配制的营养基质即为培养基。

细胞全能性：植物体每一个细胞都具有该植物所有的遗传信息,在合适的条件下,具有形成完整植株的能力。

脱分化：一个成熟细胞恢复到分生状态或胚性细胞状态的现象。

再分化：是脱分化细胞重新恢复细胞分化能力，沿着正常的发育途径，形成具有特定结构和功能的细胞。ﻫ二、组织培养的类型，不同分类依据。

（根据培养材料不同)可分为植株培养,胚胎培养,器官培养,组织或愈伤组织培养，细胞或原生质体培养5类;

(根据培养目的)可分为试管嫁接,试管受精，试管加倍,试管育种等;ﻫ(根据培养方法）可分为平板培养,微室培养,悬浮培养,单细胞培养等；

(根据培养过程）可分为初代培养和继代培养；

（根据培养基类型）可分为固体培养和液体培养。ﻫ三、三个发展阶段的关键人物。ﻫ1,haberlandｔ--－于１９20２３提出植物细胞全能性理论，被称为“组织培养之父”。ﻫ2，white--－于194３年出版《植物组织培养手册》。

3,mｕrashinｅ和skoog--－在1９62年筛选出MS培养基。四、植物全能性表达的过程ﻫ培养脱分化再分化培养组织培养的特点：ﻫ1、植物基础学科研究的良好系统。

２、生物技术的基础。ﻫ3、经济高效，管理方便,利于自动化。ﻫ4、技术含量高,实验误差小,人工控制能力强。ﻫ5、生长周期短,生长速度快,实验反复性好。

６、实验材料经济，来源单一。缺陷：需要设备负复杂，投入资金多,电能消耗大;对人员技术水平规定高，对实验场合规定也高，不能代替田间实验。第二章植物组织培养设备与培养条件

一、实验室的组成及重要仪器和设备

准备室：干燥箱,高压灭菌锅,电子天平,酸度计,水浴锅,冰箱。ﻫ接种室：超净工作台，紫外灯，接种工具。

培养室：培养架，摇床,控温控光设备。二、植物组织培养所需要的环境条件

１、温度:一般植物生长的最适温度在２3~2７℃之间。

２、光照：光照16h,接着8h的黑暗培养,光照强度一般在1000~5０00Lx。

３、湿度：一般规定7０%~８０%。

4、气体:低氧有助于胚状体的形成;高氧有助于根的形成；高浓度乙烯对正常的形态发生不利。

5、培养基渗透压：培养材料和培养基之间处在等渗或略低于培养基渗透压。

6、pH值：常在５．6~5.8.调高不调低。ﻫ三、物理灭菌的方法及条件有哪些?化学灭菌的药剂有哪些？

1、物理灭菌

湿热灭菌：运用高压蒸汽实现灭菌。在１１8kPa的压力下，121℃,维持２0分钟。ﻫ干热灭菌:运用烘箱烘烤灭菌的方法。1６0℃,灭菌时间2~3小时ﻫ过滤灭菌

射线灭菌:紫外线照射灭菌ﻫ离心沉淀,大量无菌水反复冲洗等技术。ﻫ２、化学灭菌ﻫ升汞、酒精、次氯酸钠、来苏水、高锰酸钾、双氧水、漂白粉、抗生素等。

四、高压灭菌锅的使用级注意事项：ﻫ（1）一方面将内层灭菌桶取出,再向外层锅内加入适量的水,使水面与三角搁架相平为宜。

（２)放回灭菌桶,预热。装入待灭菌物品。注意不要装得太挤,以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果，或堵塞排气孔。ﻫ（3)加盖,并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓,使螺栓松紧一致,勿使漏气。

(4）用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀,使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后,关上排气阀，此操作反复两次。当锅内压力升到所需压力时,控制热源,维持压力至所需时间。1２1.3℃，20分钟灭菌。ﻫ（5）灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降,当压力表的压力降至０时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子,取出灭菌物品。

（6)将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时,经检查若无杂菌生长,即可待用。(仅供参考）:培养基及其制备一、培养基有哪些组成成分?其作用是什么？重要成分：１.无机营养①大量元素,N(作用是蛋白质、酶的组成物质);P（是磷脂的重要成分）;S(是含S氨基酸和蛋白质的组成成分）;Ｋ（能促进碳水化合物的合成、转移，以及与氮素代谢有密切关系）；Ca(是细胞壁的组成成分，Cａ及钙调素在细胞信号转导中起重要作用）；Mg（是叶绿体的组成成分、激酶的活化剂）;②微量元素Fｅ(是某些氧化酶的组成成分,是叶绿素形成的必要条件)；Cｕ（能促进离体根的形成);Mn(参与植物光合和呼吸代谢,是氧化还原酶的成分）；B（影响碳水化合物的运送）；Ｚn(是合成色氨酸的成分）;Ｍo(是合成硝酸还原酶的成分)；2、有机营养成分①碳源（作用是提供骨架和能源;维持渗透压；影响分化；促进胚状体的发育）②维生素类（作用是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，促进生长和分化，Ｖc能防止褐化）③肌醇（作用是促进糖的转化;是细胞壁的构成原料；促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成)④氨基酸（作用是是蛋白质的组成部分,也是很好的有机碳源)⑤天然复合物(作用是促进某些愈伤组织和器官的生长)植物生长调节物质。①生长素类（诱导愈伤组织的形成,根的分化以及细胞的分裂和伸长,诱导胚状体产生)②细胞分裂素类（促进细胞的分裂、分化,诱导胚状体和不定芽的形成，延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成）③赤霉素(加速细胞的伸长生长,促进细胞分裂。）④脱落酸(克制细胞分裂和伸长、促进脱落和衰老、促进休眠和提高抗力能力等作用。)⑤多胺（调控部分外植体不定根、不定芽、花芽、体细胞胚发生发育和延缓原生质体衰老、促进原生质体分裂及细胞克隆方面有显著作用)多效挫(重要用于试管苗的壮苗,生根,提高抗逆性以及移栽成活率等方面)4、其他成分。①凝固剂（支持物，重要是对培养材料起固定或支持作用)②活性炭(作用是吸附培养基和培养物分泌物中的克制物质，可克制外植体褐变,防止玻璃苗的产生,还能促进培养物的生长和分化以及促进生根)③抗生素(作用是防止外植体内生菌导致的污染)④抗氧化物(作用是克制外植体褐变）⑤硝酸银(作用是克制乙烯气体的活性,少量的AgNＯ３促进愈伤组织器官的发生或体细胞胚的发生,并能使本来再生困难的物种分化出再生植株，对克服试管苗玻璃化及早衰和落叶有明显效果）。二、植物生长调节物质的种类,溶解及作用?1、生长素类作用是诱导愈伤组织、根的分化以及细胞的分裂和伸长;与一定量的细胞分裂素配合可诱导不定芽,以及胚状体的产生一般生长素溶于９５％酒精或0.1ｍoｌ/L的NaOH(或ＫOH）中2、细胞分裂素作用是促进细胞的分裂和分化,诱导胚状体和不定芽的形成,延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成细胞分裂素一般溶于0.5或1mol／L的ＨCl或稀薄的NaＯｈ3、赤霉素类作用是加速稀薄的伸长生长和促进细胞分裂，对组织培养中的器官和胚状体的形成表现克制作用,但对以形成的器官和胚状体的生长则有促进作用赤霉素最佳以95％酒精配成母液在冰箱保存4、脱落酸类作用是促进体细胞胚的发生，克制异常体细胞的发生,对部分之物语组织培养中不定芽的分化有一定促进作用溶解:实验室很少用到5、多胺类作用是调控部分植物外植体不定根、不定芽、花芽、体细胞胚发生发育以及延缓原生质体衰老,促进原生质体分裂及细胞克隆形成方面具有明显的效果溶解:多胺与乙烯的生物合成有共同的前体6、多效挫重要用于试管苗的壮苗,生根,提高抗逆性以及移栽成活率等方面多效挫可溶解于水中三、储备液的制备及注意事项:储备液Ｉ大量元素，浓缩20倍，配制1Ｌ培养基应取5０ｍl储备液II微量元素，浓缩200倍，配制1L培养基应取5ml储备液ＩII铁盐，浓缩２００倍，配制1L培养基应取５ｍl储备液IV有机物，浓缩２0０倍,配制1L培养基应取5mｌ植物生长调节物质，母液浓度一般为1mg／mＬ或0.1ｍg/mｏL，用时根据需要取用。注意事项:(1)配制母液及培养基要用纯度较高的蒸馏水或去离子水，药品应采用纯度等级较高的分析纯或化学纯,以免带入杂质和有害物质对培养材料产生不利影响。药品称量、定容时应特别细心、准确,特别是生长调节物质和微量元素。(3）每次称量药品时,应特别注意防止药匙污染而引起的药品交叉污染。（4）各种药品先以少量水令其充足溶解，然后依次混合。（5）母液配制前应根据培养基配方及所需制成母液配制表,按表逐项配制。四、培养基的制备及注意事项准备工作1.实验用品的准备。2.试剂、药品的准备。３.根据培养基的配方、母液扩大倍数及需要配制的培养基体积计算母液移取的量。配制过程具体操作：１.取规定数量的糖源(常用蔗糖）和凝固剂，置于烧杯或搪瓷锅内，加蒸馏水或去离子水，使用电炉加热溶解；若是液体培养基，无需加热。注意事项：不断搅拌防止琼脂凝固，溶解充足，放置石棉网，以免粘锅及烧焦底部蔗糖；注意火候，以免溢出。2.根据计算所需量依次加入储备液Ⅰ、储备液Ⅱ、储备液Ⅲ、储备液Ⅳ、生长调节物质母液及其他特殊附加物，搅拌均匀。注意事项:移液器（移液管或移液枪)对号专用,避免交叉污染;母液发生沉淀或变色，则不能使用，应重新配制;若出现结晶,应加热使其完全溶解后再使用。３.加水定容至规定体积,搅拌均匀。注意事项：定容准确，注意温度的变化影响定容体积。调整培养基的pH值:５.5-6．０注意事项:ｐH值要适宜,偏大，会使培养基发硬，反之培养基太软不易凝结;1mol/Ｌ的HＣl或NaＯH调节;高温灭菌后，pH值常下降约0.1-0．5个单位。5．分装注意事项:尽快分装;直接注入法或虹吸分注法;避免将培养基粘到容器内壁及容器口；已经分装的培养基分装到培养容器中的培养基应当占该容器的１／3－１/4；应当做上标记,注明配制日期和培养基种类。6、封口注意事项：封口膜应具有透光、透气性,但不通透尘埃、微生物等杂质,以免培养基污染;封闭容器所用材料的尺寸应为被覆盖容器上口直径的３-4倍见方。７、培养基灭菌高压蒸汽灭菌过滤灭菌注意事项及为高压灭菌时需注意的规定(结合自己理解记忆）８、冷却取料，封存备用。第四章:植物材料一、概念---幼年期：指植物初期生长发育过程成年期:指植物后期生长发育过程。复壮:指用来描述树木组织或细胞形态发生幼态特性的恢复过程。二、外植体的选择的原则:１植物的种质（种类及品种或类型）选择一般选a易于离体培养的种类及品种或类型b选生产上或研究上意义比较大的种类及品种或类型c考虑褐变2选择有良好增殖能力的外植体３选择合适大小的外植体，一般在０．5~1cm，脱毒培养植物材料应在0.２~0.5cｍ4外植体的年龄和着生部位幼年植物的外植体、成年树的下部取材、有年数的下部取材、带芽的外植体分生组织、分化组织构成的外植体5取外植体的季节和时间一般选处在生长季,较幼嫩的外植体；春夏取材灭菌容易,秋冬季取材难以成活；雨季湿热季节取材不容易成功6木本材料的特殊性a纯系比较难于获得b年龄效应应比较明显，高年龄材料难于培养野生大树取材困难，灭菌难,增生难,不同取样不一c位置效应比较明显,不同取样部位,培养结果不一d经常进行幼化解决e由于数年田间生长因素,杂菌感染严重f木本植物材料经常出现深休眠，需要预先解除休眠。所以一方面选择已有的无菌材料，再考虑选用温室植物,最后才从野外生长植株上取材。第五章植物离体快速繁殖一、概念--－植物离体快速繁殖：又称微体快繁，指运用植物组织培养技术进行的一种营养繁殖方法:是常规营养繁殖方法夫人一种扩展和延伸。褐变：酚类化合物被多酚氧化物氧化成褐色醌类物质和水醌类物质又会与luo氨酸酶发生作用使外植体蛋白质聚合，导致外植体生长停顿，直至死亡。玻璃化:试管苗的茎，叶变成透明水浸状，生长畸形，增殖系数明显下降，难以诱导生根，即使诱导生根,其根系质量极差,移栽成活率极低的现象。二、离体快速繁殖的意义及基本程序意义:1）繁殖系数高,繁殖周期短,繁殖速度快：2）应用广泛，是推广良种的重要手段:3)繁殖材料用量少。不受季节限制，可实现工厂化生产;4）能获得无毒苗木无性系;5)木本植物应用潜力大。程序:1)稳定的无菌培养体系的建立时期;2）稳定培养系的增殖：３）诱导茎芽生根形成小苗时期：4)生根小苗移栽和驯化时期。三、离体快繁的影响因素内因：1）外植体,类型及其生理状况，大小，年龄及生理状况。２）继代培养次数３)愈伤组织的遗传特性及生理状态4)芽的增殖途径:嫩梢扦插增殖途径丛生芽增殖途径器官发生增殖途径胚状体增殖途径原球茎途径外因:1)培养基２）培养条件四、污染问题:因素,类型以及防止来源：一是由于材料表面消毒不彻底,植物材料带入培养过程,或是植物内生菌随材料带入培养过程;二是无菌操作过程中有外界环境进入培养容器导致。类型：细菌性污染和真菌性污染防止:1）选择植物材料2)严格消毒灭菌3）合理安排繁殖程序4)规范操作，控制环境条件五、褐变问题：因素以及防止因素：酚类化合物被多酚类氧化物氧化成褐色的醌类物质和水。防止:1）选择适宜的外植体和培养条件2)连续转移（继代培养)3)加入抗氧化剂六、增殖途径芽的增殖途径：嫩梢扦插增殖途径丛生芽增殖途径器官发生增殖途径胚状体增殖途径原球茎途径七、试管苗移栽提高试管苗移栽成活率的措施:１)提高试管生根质量2）加强移栽前炼苗3）保证组培苗移栽基质质量４)作好移栽前根系解决５)炼苗后的湿度控制，温度控制，光照控制。第六章植物愈伤组织培养一、概念－--愈伤组织:在组织培养中,指在人工培养基上由外植体组织的增生细胞产生的一团不定形的疏松排列的薄壁细胞。胚状体:植物组织培养过程中可以产生与正常合子胚相似的结构,也称为体细胞胚二、愈伤组织的类型及其特点，形成过程？类型：松脆愈伤组织有大量的分生组织中心,进行活跃的细胞分裂，为大而未分化夫人细胞所分开，其愈伤组织内有大量的细胞间隙,细胞排列毫无顺序。致密愈伤组织内无细胞间隙,而由管状细胞组成维管组织。形成过程;诱导期分裂期形成期分化期三、优良愈伤组织的特点１)高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植株;2)容易散碎,，以便用这些愈伤组织建立优良悬浮液,并且在需要时能从中分离出全能性原生质体；3)旺盛的自我增殖能力,以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。4）通过长期继代保存而不丧失胚性,以便有也许对它们进行各种遗传操作。四、愈伤组织的定向诱导加入高浓度的生长物质，可使坚实的愈伤组织变为松脆减去或除去生长物质,松脆变坚实控制转变的因子是:植物激素和氮源形态,生长素促使细胞进入松脆，细胞分裂素促使细胞进入坚实，还原氮(氨态氮)具有促进细胞分裂，硝态氮具有克制细胞分裂的作用第七章体细胞胚胎的发生一、概念-－-体细胞胚胎的发生；是指双倍体或单倍体的体细胞(非合子细胞)在特定条件下,未经性细胞融合而通过与合子胚胎发生类似的途径发育出新个体的形态发生过程人工种子：是指将植物离体培养过程中产生的胚状体，重要是指体细胞胚，或者能发育成完整植株的分生组织（不定芽,小鳞茎，短枝,毛状根，愈伤组织,胚状体等）,包裹在有养分和具有保护功能的物质中形成的类似于天然植物种子的结构,即都具有活力的胚胎和有营养和保护作用的外部结构，并在适宜条件下能发芽出苗的颗粒二、体细胞胚胎发生特点？阶段？特点:1)体细胞具有两极性2)存在生殖隔离3)遗传性相对稳定４)重演受精卵形态发生的特性5)体细胞胚胎发生具有普遍性与两极性等特点阶段：胚性愈伤组织的诱导,体细胞胚的诱导，体细胞胚初期的分化发育（球形胚到鱼雷形胚的发育）,体细胞胚成熟以及体细胞胚萌发和成苗。或者：胚性愈伤组织和体细胞胚的诱导体细胞胚的初期分化发育体细胞胚的后期生长发育三、影响体细胞胚胎发生的因子1、外植体2、培养基3、植物生长调节物质4、环境因子5、培养容器和培养基状态四、人工种子的优点1）使生产不受外界自然条件影响和土地制约,一年四季在室内都可以生产2）快捷高效的繁殖方式,缩短育种时间3）可以人为赋予种子多种优良品质4)固定杂种优势5）对于一些自然繁殖困难的名优珍贵品种，均可采用人工种子技术进行快速大量的繁殖6）人工种子可以培养的芽,胚保持自然种子的机能,不易霉变,从而便于组织物的保存与运送。第八章植物细胞培养概述几个概念－-－植物细胞悬浮培养:即用类似于微生物培养所用发酵罐的生物反映器，提供满足细胞正常生长和生物物质合成的可控环境,进行细胞大量培养的方法。单细胞培养:又叫单细胞克隆技术。是指纯粹单离的细胞成群培养的方法。平板培养:将具有０.6%琼脂的培养基冷却到35℃（尚未固化)，将悬浮液接种进去,充足混合，倒入9cm的培养皿中,约铺成1mm厚薄层，培养皿用塑料膜封口的培养方法。条件培养：在选用的培养基中，加入一定量已生长过组织或细胞的培养液来培养细胞的培养方法。看护培养:将愈伤组织直接置于铺有单细胞的滤纸下,作为看护愈伤组织来培养细胞的方法。微室培养:用条件培养基代替了看护组织，将细胞置于微室中进行培养的培养方法。液体浅层培养：先在培养皿中注入浅层液体培养基,再接种已分散的单细胞的培养方法。起始细胞密度：指开始培养时,单位体积内的细胞数目。二、细胞培养的方法答：植物细胞培养可以分为大量细胞培养和单细胞培养两类。其中大量细胞培养又分为悬浮培养和固化培养两类。植物细胞悬浮培养又可分为成批悬浮培养和连续悬浮培养两类。植物单细胞培养又可分为平板培养、条件培养、看护培养三类。第九章植物组织培养脱毒一、病毒的分布规律答:病毒在植物体内分布不均一。越接近生长点病毒浓度越稀。二、脱毒的原理及方法答:１.热解决脱毒法原理:eｑ\o\ａｃ（○,１)病毒ＤNＡ分子进入细胞后随植物细胞的DNA一起复制。热解决并不能杀死病毒,只能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止,而失去传染能力。ｅq＼ｏ\aｃ(○，2）热解决是一种物理效应，与冷解决同样可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜处在优势地位。方法:ｅq\o\ac（○,１)愈伤组织热解决eq\ｏ\ac(○,２)热空气解决脱毒法2.微茎尖培养脱毒(1)原理:eｑ\o\ａc(○,1)病毒在植物体内分布不均匀，越接近顶端分生组织,病毒浓度越稀，因此可以采用小茎尖的离体培养脱除植物病毒。eq＼ｏ\ac(○,2).病毒ＤNＡ分子与细胞分裂蛋白质合成竞争,在迅速合成的植物细胞中正常合成的蛋白质占优势。（2）方法：外植体经表面灭菌后,在解剖镜下,经无菌操作切取小茎尖,接种到备用培养基上,放入培养室内进行培养,并及时观测和记录培养结果。３.愈伤组织培养脱毒法(1)原理：eq\o＼aｃ(○,１）病毒在植物体内不同器官或组织分布不均匀。eq\ｏ\ａc(○,2)病毒在愈伤组织的快速增值中,复制能力衰退或丢失。eq\o＼ａｃ(○,3）继代培养的愈伤组织产生抗性变异。（2）方法：植物各种器官或组织诱导出愈伤组织,愈伤组织多次继代,然后从愈伤组织再诱导分化芽，长成植株。4.珠心组织培养脱毒法病毒是通过维管组织传播的,而珠心组织和维管束系统无直接联系,故可以通过珠心组织离体培养获得无病毒植株。5.微体嫁接离体培养脱毒法(１)原理:由于微体嫁接的接穗是很小的茎尖，微茎尖的带毒几率很小,故采用微体嫁接的方法可以获得无毒苗。（2）方法:把极小(小于0.2mm)的茎尖作为接穗嫁接到实生砧木上(无菌种子培养获无菌苗,种子实生苗不带毒）,然后将嫁接后的砧木接种到新的培养基上培养。植物脱毒苗的检测与保存答:1.检测:视觉观测法生物鉴定法抗血清鉴定法分光亮度法2．保存：（1)隔离种植保存(2）离体保存第十章:植物胚胎培养一、概念---胚胎培养:对植物的胚及胚器官进行人工离体无菌培养，使其发育成幼苗的技术。胚培养:将受精后的果实或种子,用药剂进行表面灭菌，然后在无菌的条件下剖开种子,剥离种胚,进行胚解决,最后接种于预先配置好的培养基上,使其在人工控制条件下,发育成一棵完整的植株。胚珠培养：将整个胚珠进行消毒，然后再严格的无菌条件下把胚剥离出来，直接置于培养基上培养。子房培养：取未授粉或授粉后的子房,进行表面消毒,在无菌的条件下接种于培养基上进行培养。胚乳培养:取胚乳已发育到细胞器的果实或种子,进行表面灭菌，然后在无菌条件下剥离