食品毒理学实验指导书

PAGEPAGE18食品毒理学实验指导郭红辉刘永吉编写韶关学院英东食品科学与工程学院2012年9月实验注意事项食品毒理学所开设实验均要用到实验动物，为保证实验安全顺利进行，特别提出以下注意事项，所有实验人员务必认真阅读，严格遵守。定，不得戏弄或者虐待实验动物。课前预习实验指导，熟悉实验操作流程，撰写预习报告。等意外事故发生；如有意外发生，马上报告老师。实验动物器官和尸体不要随意丢弃，交由班级指定负责人集中处理。实验结束后，清洗和整理好实验用具，交由老师清点后方可离开。实验一实验动物的基本操作一、目的和意义毒理学研究需要用实验动物来进行各种实验，通过对动物的实验观察和分析来-掌握动物实验基本操作是毒理学研究必备技能。二、实验器材及试剂1、器材1.50.5mlEP管等2、试剂（1~苦味酸溶液（即２，４，６－三硝基苯酚的蛋白发生反应，可染成较为牢固的亮黄色。可用水，也可用一定浓度的乙醇来配制。（2）0.5%中性红或品红溶液,可染成红色。三、内容（一）健康动物的选择无论选择哪种种属品系的动物进行实验，均要求选择健康的实验动物。健康动物检查时要求达到：外观体形丰满，被毛浓密有光泽、紧贴体表，眼睛明亮，行动迅速，反应灵活，食欲及营养状况良好。（二）实验动物性别的鉴定动物性别不同对毒物的敏感性也不同，这可能与性激素、肝微粒体羟基化反应有关，也随受试物而异。因此，要根据实验要求选择性别，一般实验如对性别无特殊要求者，以选用雌雄动物各半。成年鼠直接观察有无外露睾丸。家兔可观察其阴部孔洞大小及其离肛门的距离。孔洞扁形略大，离肛门较近的为母兔；孔洞圆形而小，离肛门较远的为公兔。对开眼后的仔兔和满月幼兔鉴别公母时，右手抱定仔兔，腹部朝上，左手中指与食指夹住兔尾，拇指轻按，掰开后形的为公兔。（三）实验动物的抓取方法以无名指按住鼠尾，小指按住后腿即可。免咬伤，可带上帆布或棉纱手套。采用左手固定法，用拇指和食指捏住鼠耳，余下三指紧捏鼠背皮肤，置于左掌心中，这样右手可进行各种实验操作。鼠背，抓住其肩胛上方，以拇指和食指环握颈部，另一只手托住臀部即可。兔的抓取方法用右手抓住兔颈部的毛皮提起，然后左手托住其臀部或腹部，让其体重的大部分重量集中在左手上。（四）实验动物的编号、标记方法0.1g5%。编号123456789。双色涂染法是采用两种颜色同时进行染色标记的方法。例如用苦味酸（黄色）染色标记作为个位数，用品红（红色）染色标记作为十位数。此法略嫌烦杂。剪耳法烙印或剪毛法号牌法植入芯片法采用独特专利技术,2mm11mm的IMI-1000织内保持位置固定,,存或液体保存,即使经过几十年的长期保存,仍然可以马上读取数据。（五）实验动物的随机分组法动物实验时，常常需要将选择好的实验动物，按研究需要分成若干个组，分组时为了避免人为的因素影响常应用随机数字表进行完全随机化的分组。（六）实验动物的被毛去除方法剪毛1）把剪刀贴近皮肤剪，不可用手提起被毛，以免剪破皮肤（2）（3）剪下来的被毛集中在一个容器内，勿遗留在手术野和操作台周围。拔毛脱毛（七）实验动物染毒途径和方法皮下注射皮下注射给药是将药液推入皮下结缔组织，经毛细血管、淋巴管吸收进入血液循环的过程。作皮下注射常选项背或大腿内侧的皮肤。操作时，常规消毒注射部位易摆动则表示已刺入皮下，再轻轻抽吸，如无回血，可缓慢地将药物注入皮下。拔0.1-0.3ml/10g体重。皮内注射接种、过敏实验等一般作皮内注射。先将注射部位的被毛剪掉，局部常规消毒，左4.5针头穿刺，针头进入皮肤浅层，再向上挑起并梢刺入，将药液注入皮内。注射后皮肤出现0.1ml/次。肌肉注射小鼠体积小，肌肉少，很少采用肌肉注射。当给小鼠注射不溶于水而混悬于油11901/4,液.0.1ml/10g体重.腹腔注射3mm450.1-0.2ml/10g体重。静脉注射兔：常用耳外缘静脉；大小白鼠：一般为静脉注射（左右二侧的；小白鼠和大白鼠：一般采用尾静脉注射，鼠尾静脉有三根，左右两侧及背侧各一根，左右两侧尾静脉比较容易固定，多采用，背侧一根也可采用，但位置容易固定。操作时先将动物固定在鼠筒内或扣在烧杯中，使尾巴露出，尾部用45～50℃的温水浸润半分钟或用酒精擦拭使血管扩张，并可使表皮角质软化，以左手拇指和食指捏住鼠尾两侧，使静脉充盈，用中指从下面托起尾巴，以无名指和小指夹住尾巴的末梢，右手持注射器连4(1/2号细针头，使针头与静脉平行（小于30℃四分之一处（2-3厘米）处进针，此处皮薄易于刺入，先缓注少量药液，如无阻力，表示针头已进入静脉，可继续注入。注射完毕后把尾部向注射侧弯曲以止血。如需反复注射，应尽可能从末端开始，以后向尾根部方向移动注射。1常用实验动物的最大给药量和使用针头规格动物名称项目灌胃皮下注射肌肉注射腹腔注射静脉注射小白鼠最大给药量1ml0.4ml0.4ml1ml0.8ml使用针头9(钝头)5(1/2)5(1/2)5(1/2)4大白鼠最大给药量1ml1ml0.4ml2ml4ml使用针头静脉切开针6665鼠最大给药量3ml1ml0.5ml4ml5ml使用针头静脉切开针6(1/2)6(1/2)75兔最大给药量20ml2ml2ml5ml10ml使用针头10号导尿管6(1/2)6(1/2)76猫最大给药量使用20ml20ml2ml5ml10ml针头10号导尿管7776蛙 淋巴囊注射 最大注射量1ml/只经口染毒：灌胃家兔等动物。小鼠、大鼠（或豚鼠）用输血针头或小号腰穿针头，将其尖端斜面磨剂，用焊锡在针尖周围焊一圆头，注意勿堵塞针孔，即成灌胃针；亦可用烧成圆头的硬质玻璃毛细管或特制的塑料毛细秋，作为导管。灌胃时将针按在注射器上，吸入药液。左手抓住鼠背部及颈部皮肤将动物固定，右手持注射器，将灌胃针插入动物口中，沿咽后壁徐徐插入食道。动物应固定成垂直体位，针插入时应无阻力。若感到阻力或动物挣扎时，应立即停止进针或将针拔出，以兔损伤或穿破食道以及误入气管。3－4cm4-6cm0.2-1ml1-4ml1-5ml。其他途径给药：呼吸道染毒皮肤染毒：a.斑贴法；b.浸尾法（八）实验动物生物材料采集和制备（八）动物常用采血方法大小鼠鼠尾采血法：剪尾法或尾静脉采血45刀或剪刀)割去尾尖0.3-0.5cm，让血液自由滴入盛器或用血红蛋白吸管吸取，采血结束，伤口消毒并压迫止血。也可在尾部作一横切口，割破尾动脉或静脉，收集血液100.1ml0.3～0.5ml鼠尾静脉刺血法大鼠用血量不多时(仅做白细胞计数或血红蛋白检查78号注射针头，刺入鼠尾静脉，拔出针头时即有血滴出，一次可采集10～50mm3期反复取血，应先靠近鼠尾末端穿刺，以后再逐渐向近心端穿刺。眼眶静脉丛采血法采血者的左手拇食两指从背部较紧地握住小鼠或大鼠的颈部(大鼠采血需带上纱手套)，应防止动物窒息。当取血时左手拇指及食指轻轻压迫动物的颈部两侧，使71ml注射器或长颈(3～4cm)硬质玻璃滴管(0.5-1.0mm)45℃的夹角，由眼内角刺入，针头斜面先向眼球，刺入后再转180度使斜面对着眼眶后界。刺入浓度，小鼠约4～5mm0.1-0.5mm，边退边抽。若穿刺适当血液能自然流入毛细管中，当得到所需的血量后，即除去加于颈部的压力，同时，将采血器拔出，以防止术后穿刺孔出血。若技术熟练，用本法短20-25g的小鼠每次可采血200-300g腹主动脉或股动/静脉采血法缔组织，夹住动脉近心端，用尖头手术剪刀，剪断动脉，使血液喷入盛器。股动(静)15-20g0.2-0.8ml，0.4-0.6ml。断头采血法采血者的左手拇指和食指以背部较紧地握住大(小)鼠的颈部皮肤，并作动物头1/2-4/50.8～1.2ml;5-10ml。家兔耳缘静脉采血法心脏采血法2.动物尿液采集代谢笼法：此法较常用，适用于大、小鼠。将动物放在特制的笼内。动物排便由于大、小鼠尿量较少，操作中的损失和蒸发，各鼠膀胱排空不一致等原因，都可5小时以上的尿液，最后取平均值。需采取少量尿液时，可提起小鼠，将排出的尿液接到带刻度的容器内。导尿法：常用于雄性兔、狗。动物轻度麻醉后，固定于手术台上。由尿道插入导尿管(顶端应用液体石蜡涂抹)，可以采到没有受到污染的尿液。（九）实验动物的处死及解剖脊椎脱臼法：多用于小鼠；右手抓住鼠用力向后拉，同时左手拇指与食指用力向下按住鼠头，将脊髓与脑髓拉断，鼠便立即死亡断头法：大小鼠；实验者戴上棉绿纱手套，用右手握住大鼠头部，左手握住背部，露出颈部，助手用剪刀在鼠颈部将鼠头剪掉。小鼠处死法相同。急性大失血法可采用鼠眼眶动脉和静脉急性大量失血方法使鼠立即死亡。击打法右手抓住鼠尾，提起，用力摔击其头部，鼠痉挛后立即死亡。用小木锤用力击打鼠头部也可致死。麻醉致死法麻醉后急性放血法空气拴塞法化学致死法吸入一氧化碳，大、小鼠在一氧化碳浓度为0.2-0.5%环境中即可致死。2.0mg/kg3.0-3.5ml/kg0.6ml/脉注入。开放性气胸法作业606组，写出计算过程和分组结果。画出自己所领取实验动物的标号示意图。实验二急性经口毒性实验一、实验目的：（一）通过本次实验掌握经口灌胃技术，半数致死剂量的意义。（二）通过本次实验学习半数致死剂量的计算及毒性判定。二、实验器材及试剂1、器材帆布手套、橡胶手套、剪刀、大头针、小鼠鼠笼、泡沫塑料板、棉签、纱布、脱脂棉、小鼠灌胃针、1ml注射器等2、试剂（1）甲醇，梯度稀释，浓度分别为75.0%、60.0%、48.0%、38.4%、30.7%和24.%三、测定方法：本实验以灌胃方式测定甲醇的半数致死量（LD。50（一）实验动物与分组：首选健康成年昆明种小鼠(8周龄，18g～25g)或大鼠(180g～220g)。3～5d况，并淘汰不健康或体重不符合要求的动物。本次实验取体重18-25g的小鼠，实验时，将小鼠称体重、编号、按随机分组原则，将实验动物分成5组，每组8只。（二）剂量选择：首先查阅与受试化学物结构及理化性质相近似的化学物的LD，以此值作为受试50化学物的预期毒性中值，即中间剂量组，再上下各推1-2个剂量组，进行预实LD约为7200mg/kgBW。但对于人，甲醇摄50入量超过4克就会出现中毒反应，误服一小杯超过10克就能造成双目失明，饮30在体内氧化生成甲醛和甲酸也都有毒性。各剂量组的间距可根据LD 计算方法要求按等比级数或等差级数安排。50本实验用机率单位法计算LD，要求按等比级数排列，常用1：0.8，如甲醇的最5012000mg/kg12000mg/kg*0.8=9600mg/kg，依次类7680、6144、4915.23932.2mg/kg（三）受试化学物配制与稀释溶剂：水溶性受试化学物以蒸馏水为溶剂配制成溶液。脂溶性受试化学物以吐温-80、二甲基亚砜、植物油等配制。（三）受试化学物配制与稀释受试物的稀释事先设计的剂量分别稀释配制为几种不同的浓度的受试物溶液。例如本次实验五个剂量组:20ml/kg等容量稀释法D：设计的染毒剂量，mg/kgV：动物给药量（相同单位体重体积）均为20ml/kgX：各组需配制的受试物溶液的浓度（mg/ml）D=12000V=0.2ml/10g(20X=600mg/ml依次类推：计算六个染毒动物组所需配制的受试物浓度第一组：600mg/ml；第二组：480mg/ml；第三组：384mg/ml第四组：307.2mg/ml；第五组：245.8mg/ml；第六组：196.6mg/ml根据以下公式计算各剂量组小鼠灌胃容量:小鼠灌胃容量Vml=体重（g）×20ml/1000g各剂量组小鼠染毒剂量（=0.8g/ml）:小鼠染毒剂量=V×各组的受试物浓度（mg/10ml)（四）灌胃方法：即深人至胃部，一般进针深度小鼠2.5～4cm，随后将受试物溶液注入。如遇动10-20ml/kg（五）中毒体征和死亡情况观察染毒后观察和记录中毒体征及出现的时间、死亡数量和时间及死亡前的特征。高剂量组动物的死亡常很快发生，染毒后应即刻密切观察。根据观察情况分析中毒特点和毒作用靶器官。观察的项目包括：抽搐麻痹、运动失调、对外反应过敏或迟钝；植物神经系统：瞳孔扩大或缩小、流涎或流泪；泌尿生殖系统：会阴部污秽、有分泌物、阴道或乳房肿胀；皮肤和毛：皮肤充血、紫绀、被毛蓬松、污秽；眼：眼球突出、结膜充血、角膜浑浊、血性分泌物；消化系统：腹泻、厌食、LD50 计算：LD50，等。由于寇氏法较常用，并有计算简便，结果较准确等特点，故推荐使用。1预备实验（1）摸索上下限：即用少量动物逐步摸索出使全部动物死亡的最小剂量（Dm和一个动物也不死亡的最大剂量（Dn。2~3低剂量；如全不死，则加大剂量再行摸索，直到找出Pm=100%和Pn=0%的剂量，此两量分别为上下限。（2）确定组数，组距及各组剂量①组数：一般5～8组，可根据适宜的组距确定组数，如先确定5组，若组距过大，可再增加组数以缩小组距。有时也可根据动物死亡情况来决定增减组数。②组距：指相邻两组剂量对数之差，常用“d”来表示。D不宜过大，因过大可使标准误增大；也不宜过小，因过小则组数增多，各组间死亡率重叠造成实验动物的浪费。组距大小主要取决于实验动物对被试因素的敏感性。敏感性大者，死亡率随剂量增加（或减少）而增加（或减少）的幅度大，组距可小些；反之，敏感性小者，死亡率随剂量变化的幅度小，则组距应大些。上下限之间的距离可作为敏感性大小的标志。距离大，说明敏感性小；距离小，则说明敏感性大。一般要求d0.155，多在0.08～0.1之间。Xk限剂量的对数值为X1，组数为G，则：d＝（Xk-X1）/（G-1）④确定各组剂量：由X1逐次加d（或由Xkd值，再分别查反对数，即得出各组剂量（呈等比级数排列。（3）配制等比药液，并使每只动物在给药容量上相等（如0.5ml/20g。⒉正式实验（1）实验动物的选择与分组①选择原则：可根据不同实验而选取动物，应选择对被试因素敏感的动物。同时也应考虑动物来源，经济价值及操作简便等条件。LD50常用小白鼠进行实验来测得。②分组原则：每组动物数必须多于组数。因为每组动物数如少于组数，就不能充分反映各组死亡率的差别。（如共8组，每组10只动物，高剂量三个组的死亡数分别为6、9、10，但如果每组只用6只动物，则高剂量三个组的死亡数可能都是6）③分组方法：见附录，实验对象分组法。首先，按性别将动物雌雄分开或各半混合编组，然后按体重分群，再随机分组，为求使各组平均体重相等。（2）给药、观察死亡数、求出死亡率①给药途径：可据不同药物及动物而定，小白鼠多用腹腔注射或灌胃法；也可静脉注射。②给药顺序：宜采取间隔跳组方法。如共7组，先按2、4、6组顺序给药，然后逆行按7、5、3、1组的顺序给药。这样可避免药物放置过久或动物饥饿造成的偏向性误差。而且当第3组给药后，如第2组动物已经全死，则可省下第1组动物及780﹪动物的给药容量可按个体体重或平均体重确定。温度等生活条件，严防非被试因素引起的死亡。LD5095四、结果评价：LD50家标准或技术规范中的急性经口毒性分级标准（农药的急性毒性分级）行毒性定级，判断受试物的毒性大小。五、注意事项：灌胃时操作要避免损伤食道或误入气管正确捉拿动物，防止被咬伤且避免动物损伤灌入量计算和操作要准确，否则影响结果操作过程中要小心。六、实验报告应包括以下内容：实验动物的种属。实验动物体重和随机分组情况。受试物的名称、性状等情况。受试物的配制和溶剂。描述实验观察的中毒表现和死亡情况等。LD50受试物的急性毒性分级、分级依据和结果评价。例：解磷定半数致死量(LD50)的测定124120％100量范围。表1求解磷定LD的预试结果50组别小鼠(只)浓度剂量给药容量死亡动物(只)死亡率（mg/ml）(mg／kg)（ml/10g）13153000.2237.51500.2333.75750.2431.8835.50.218～22g50510最好雌雄各半，各组按表210:8，给药2表2求解磷定LD50的结果组别小鼠剂量对数剂量死亡动物死亡率(只)(mg／kg)(只)1103002.482102402.383101922.284101542.185101232.08计算方式 根据正式实验各组死亡率按下列公式求出解磷定腹腔注射的LD50和可信限(P＝0.95)。0％，100％时，可按下列公式计算LD：50LD＝lg-1[Xm-i(∑p－0.5)]500％100％而又大于70％时，可按下列校正公式计算LD：503-Pm-PnLD＝lg-1[Xm-i(∑p－ )]50 4LD的标准误：S50

＝i2n-1LD的平均可信限：LD±4.5S LD（P＝0.9。50 50 x50 50剂量组)，Pm为最大剂量组死亡率，Pn为最小剂量组死亡率，P为每组动物数。作业1、记录注射不同剂量甲醇后小鼠的急性毒性表现，汇总后计算LD50及其95%可信限。295%可信限。灌胃剂量（g/kg）： 5.12 6.40 8.00 10.0 12.5死亡数/实验动物数：1/10 2/10 4/10 7/10 9/10实验三小鼠骨髓多染红细胞微核试验目的和意义微核试验用于检测受试物在哺乳动物所引起的染色体或原红细胞有丝分裂器损伤，以确定该受试物有无诱变性。通过本次实验学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞微核测定方法。原理正常细胞的有丝分裂的分裂中期，染色体均匀地排列在赤道板附近，到分裂后期便分成两份，分别向两极移动，并在末期分别形成两个子细胞的核。如果由于某种化学物质的作用而使分裂期的细胞染色体受到损伤，在中期就会观察到染色体断当其它染色体分别形成子细胞核时，这些落后的断片便独立形成微核，如果纺锤体功能受损，也可产生微核。由上可见，微核的出现和染色体畸变有密切相关性，同时微核的观察是在细胞的间期，不必分析中期相，这比分析染色体畸变要方便一些。进行骨髓细胞微核分析一般观察红细胞，记数嗜多染红细脑中微核出现率。器材与试剂1、器材架、滤纸、电吹风机、染色缸、研钵、恒温水浴箱、光学生物显微镜（镜。2、试剂甲醇；吉姆萨储备液：将1g66ml，转移到烧杯内（或试剂瓶内55~602h60ml甲醇，混匀后置室温，2~3瓶内备用（存放时间越长染色效果越好。吉姆萨染色液：实验前取吉姆萨储备液与磷酸盐缓冲液（pH6.8）1:9混匀。磷酸盐缓冲液（pH6.8）阳性对照物：环磷酰胺。操作步骤一、试验动物及处理1、动物的选择：选用小鼠，每组10只动物，雌雄各半。小鼠体重在18~20g，7~12w。2、染毒途径：采用腹腔注射给药。350mg/kg（空白对照。4、染毒次数和取样时间：采用30h给药法，即两次给药间隔24h，在第二次给药后6h处死动物采集骨髓。二、骨髓液的制备和涂片脱颈椎处死小鼠，立即取出胸骨，除去胸骨上的血液和肌肉，横向切断胸骨，暴露骨髓腔挤出骨髓，小心地涂布于载玻片一端的胎牛血清液滴里，混匀涂片。三、固定15四、染色1015自然晾干。五、镜检可出现一个或多个微核。计数1000PCE中含微核的PCE数，并且计数200PCENCE的比值。六、结果分析与评价PCEPCE/NCE（0.6~1.<0.PCE形成受到严重抑制，受试化学物的剂量过大，试验结果不可靠。实验四小鼠精子畸形试验1实验目的掌握小鼠精子畸形试验的基本技术要