第八章真核基因表达调控

第八章真核基因表达调控第一页，共九十三页，2022年，8月28日●基本概念●真核基因表达调控一般规律●真核基因表达的转录水平调控●真核生物DNA水平的基因表达调控●真核基因其他水平的表达调控Contents第二页，共九十三页，2022年，8月28日断裂基因：在一个结构基因中，编码某一蛋白质不同区域的各个外显子并不连续排列在一起，常常被长度不等的内含子所隔离，形成镶嵌排列的断裂方式。具有这种结构特征的基因被称为断裂基因。真核生物基因为断裂基因。外显子：真核基因中的编码序列，称为外显子。内含子：真核基因中的非编码序列，称为内含子。第三页，共九十三页，2022年，8月28日第四页，共九十三页，2022年，8月28日外显子与内含子链接区结构特征第五页，共九十三页，2022年，8月28日第六页，共九十三页，2022年，8月28日Ⅰ类内含子的自我剪接第七页，共九十三页，2022年，8月28日Ⅱ类内含子的自我剪接第八页，共九十三页，2022年，8月28日基因家族：真核细胞中许多相关的基因常按功能成套组合，被称为基因家族。简单多基因家族：功能相关的基因以串联方式前后相连。如真核生物5.8S，18S,28SrRNA的结构基因组成简单多基因家族。复杂多基因家族：一般由几个相关基因家族构成。如组蛋白基因家族。发育调控的复杂多基因家族：如血红蛋白基因家族第九页，共九十三页，2022年，8月28日●基本概念●真核基因表达调控一般规律●真核基因表达的转录水平调控●真核生物DNA水平的基因表达调控●真核基因其他水平的表达调控Contents第十页，共九十三页，2022年，8月28日真核生物基因调控分类：瞬时调控：或称可逆调控，真核细胞对环境条件变化做出的反应。发育调控：或称不可逆调控，是真核细胞在生长、分化，发育过程中基因受到的调节。第十一页，共九十三页，2022年，8月28日●基本概念●真核基因表达调控一般规律●真核基因表达的转录水平调控●真核生物DNA水平的基因表达调控●真核基因其他水平的表达调控Contents第十二页，共九十三页，2022年，8月28日1真核细胞的基因与原核细胞基因表达差异真核细胞与原核细胞在基因转录、翻译及DNA的空间结构方面存在很大的差异，主要表现在以下几个方面：

(1)在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，不存在原核生物中常见的多基因操纵子形式；

(2)真核细胞DNA与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部DNA是裸露的；

(3)真核细胞中存在着一部分由几个或几十个碱基组成的DNA序列.它们在整个基因组中重复几百次甚至上百万次.高等真核细胞DNA中很大一部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子；第十三页，共九十三页，2022年，8月28日

（4）真核生物能够根据生长发育阶段的需要进行DNA片段的有序重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数，这种能力在原核生物中是极为鲜见的；（5）原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于启动子上游不远处。调控蛋白结合到调节位点上后可直接促进或抑制RNA聚合酶对它的结合。而在真核生物中，基因转录的调节区则大得多，它们可能远离启动子达几百个甚至上千个碱基。虽然这些调节区也能与蛋白质结合，但是并不直接影响启动子区对于RNA聚合酶的接受度，而是通过改变整个所控制基因5’上游区DNA的构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力；第十四页，共九十三页，2022年，8月28日

（6）真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质，原核生物中不存在这样严格的空间间隔；（7）许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟（maturation）和剪接（splicing）过程才能顺利翻译成蛋白质。第十五页，共九十三页，2022年，8月28日

2、真核基因的一般结构特征第十六页，共九十三页，2022年，8月28日

真核细胞的三种RNA聚合酶(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)中，只有RNA聚合酶Ⅱ能转录生成mRNA，以下主要讨论RNA聚合酶Ⅱ的转录调控。顺式作用元件(cis-actingelements)

真核基因的顺式调控元件是基因周围能与特异转录因子结合而影响转录的DNA序列。其中主要是起正性调控作用的顺式作用元件，包括启动子(promoter)、增强子(enhancer)。近年又发现起负性调控作用的元件沉寂子(silencer)。第十七页，共九十三页，2022年，8月28日1、启动子(1)真核启动子序列比原核启动子复杂的原因：

a.真核启动子不像原核那样有明显共同一致的序列，且单靠RNA聚合酶难以结合DNA而起动转录，而是需要多种蛋质因子的相互协调作用;b.不同蛋白质因子又能与不同DNA序列相互作用，不同基因转录起始及其调控所需的蛋白因子也不完全相同。（2）真核启动子中的元件真核启动子一般包括转录起始点及其上游约100－200bp序列，包含有若干具有独立功能的DNA序列元件，每个元件约长7－30bp。第十八页，共九十三页，2022年，8月28日a.核心启动子元件(corepromoterelement)

指RNA聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列，包括转录起始点及其上游－25/－30bp处的TATA盒。核心元件单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录。b.上游启动子元件(upstreampromoterelement)

包括通常位于－70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距转录起始点更远的上游元件。这些元件与相应的蛋白因子结合能提高或改变转录效率。不同基因具有不同的上游启动子元件，其位置也不相同，这使得不同的基因表达分别有不同的调控。第十九页，共九十三页，2022年，8月28日2、增强子是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在SV40病毒中发现的长约200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物，甚至在原核生物中都发现了增强子。增强子通常占100－200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为8－12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。增强子的作用有以下特点：⑴增强子提高同一条DNA链上基因转录效率，可以远距离作用，通常可距离1－4kb、个别情况下离开所调控的基因30kb仍能发挥作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。⑵增强子作用与其序列的正反方向无关。第二十页，共九十三页，2022年，8月28日

⑶增强子要有启动子才能发挥作用，没有启动子存在，增强子不能表现活性。但增强子对启动子没有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型启动子的转录。例如：a.当含有增强子的病毒基因组整合入宿主细胞基因组时，能够增强整合区附近宿主某些基因的转录；b.当增强子随某些染色体段落移位时，也能提高移到的新位置周围基因的转录。c.使某些癌基因转录表达增强，可能是肿瘤发生的因素之一。⑷增强子的作用机理虽然还不明确，但与其他顺式调控元件一样，必须与特定的蛋白质因子结合后才能发挥增强转录的作用。增强子一般具有组织或细胞特异性，许多增强子只在某些细胞或组织中表现活性，是由这些细胞或组织中具有的特异性蛋白质因子所决定的。第二十一页，共九十三页，2022年，8月28日6.3.3基因调控的反式作用因子

1、反式作用因子是与顺式元件相互作用的调控转录的转录因子。目前已发现了许多反式作用因子，其中主要是蛋白质，例如：（1）识别GGGCGG的转录因子SPl；（2）识别CCAAT框的CTF；（3）热震惊基因的转录因子HSTF；（4）固醇类激素受体；（5）cAMP的受体CAP等。有些转录因子如Apl是由原癌基因jun所编码的，这引起了人们极大的兴趣，它向人们提供了胚胎分化和癌症发生的新线索。下面仅以SP1为例来了解转录因子的一般情况：第二十二页，共九十三页，2022年，8月28日

例：SPl是从人类细胞中分离到的一种转录因子，是SV40转录所必需的：（1）它所识别的序列GGGCGG是非对称的，而且其作用是双方向的；（2）在SV40的启动子中有六个这样的GC框，SPl与其中的三个结合较强，与两个结合较弱，还有一个不结合；（3）每个SPl可以保持大约20bp的DNA；（4）SV40启动子中的GC框可促进早期和晚期基因的转录。现在已经发现许多真核基因的启动子都含有GC框，艾滋病毒基因启动子中也含有GC框。不同的启动子中GC框具有不同的排列方式。第二十三页，共九十三页，2022年，8月28日2、反式作用因子(transactingfactors)：以反式作用影响转录的因子可统称为转录因子(transcriptionfactors,TF)。与RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ相应的转录因子分别称为TFⅠ、TFⅡ、TFⅢ，对TFⅡ研究最多。真核基因转录需要基本的TFⅡ。

RNA聚合酶Ⅱ的基本转录因子(见下表）：第二十四页，共九十三页，2022年，8月28日

不同基因由不同的上游启动子元件组成，能与不同的转录因子结合，这些转录因子通过与基础的转录复合体作用而影响转录的效率。现在已经发现有许多不同的转录因子，看到的现象是：

(1)同一DNA序列可被不同的蛋白因子所识别；

(2)能直接结合DNA序列的蛋白因子是少数，但不同的蛋白因子间可以相互作用，因而多数转录因子是通过蛋白质－蛋白质间作用与DNA序列联系并影响转录效率的(见图4)。转录因子之间或转录因子与DNA的结合都会引起构象的变化，从而影响转录的效率。第二十五页，共九十三页，2022年，8月28日3、转录因子从功能上分析其结构可包含有不同区域：⑴DNA结合域(DNAbindingdomain)，多由60－100个氨基酸残基组织的几个亚区组成；⑵转录激活域(activatingdomain)，常由30－100个残基组成，富含酸性氨基酸、谷氨酰胺、脯氨酸等不同种类，以酸性结构域最多见；⑶连接区，即连接上两个结构域的部分。不与DNA直接结合的转录因子没有DNA结合域，但能通过转录激活域直接或间接作用于转录复合体而影响转录效率。第二十六页，共九十三页，2022年，8月28日4、与DNA结合的转录因子大多以二聚体形式起作用，与DNA结合的功能域常见有以下几种：⑴螺旋—转角—螺旋(helixturnhelix,HTH)及螺旋-环-螺旋(helixloophelix,HLH)：这类结构至少有两个α螺旋，其间由短肽段形成的转角或环连接，两个这样的motif结构以二聚体形式相连，距离正好相当于DNA的一个螺距(3.4nm)，两个α螺旋刚好分别嵌入DNA的深沟。第二十七页，共九十三页，2022年，8月28日⑵锌指(zincfinger)：其结构如图所示，每个重复的“指”状结构约含23个氨基酸残基，锌以4个配价键与4个半胱氨酸、或2个半胱氨酸和2个组氨酸相结合。整个蛋白质分子可有2?个这样的锌指重复单位。每一个单位可以其指部伸入DNA双螺旋的深沟，接触5个核苷酸。例如与GC盒结合的转录因子SP1中就有连续的3个锌指重复结构。第二十八页，共九十三页，2022年，8月28日⑶碱性－亮氨酸拉链(basicleucinezipper,bZIP)：该结构的特点：蛋白质分子的肽链上每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基，结果就导致这些亮氨酸残基都在α螺旋的同一个方向出现。两个相同结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结合成二聚体，该二聚体的另一端的肽段富含碱性氨基酸残基，借其正电荷与DNA双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合。若不形成二聚体则对DNA的亲和结合力明显降低。例如：在肝脏、小肠上皮、脂肪细胞和某些脑细胞中有称为C/EBP家族的一大类蛋白质能够与CAAT盒和病毒增强子结合，其特征就是能形成bZIP二聚体结构。

第二十九页，共九十三页，2022年，8月28日第三十页，共九十三页，2022年，8月28日5、转录激活结构域⑴酸性结构域最初从酵母调节蛋白GAL4和GCN4转录因子中分析鉴定，在他们的表面含有一束带负电荷的酸性氨基酸，能形成螺旋结构，它是通过促进转录因子在启动子上的装配而实现酸性激活的。例如：GAL4调节蛋白借助这种酸性负电荷表面结合于自身的DNA结合位点后，帮助TFIIB克服装配上的阻塞，从而成千倍增加转录。⑵富含谷氨酰胺的结构已经测的Sp1调节蛋白中有4个被分开的激活结构域，其中两个激活最强的结构域含谷氨酰胺约为25%，在Oct-1,Oct-2,Ap-2和血清应答因子（SRF）等转录因子也都有此特点。第三十一页，共九十三页，2022年，8月28日（3）富含脯氨酸的结构域在CTF－NF1转录因子羧基端含有（脯氨酸）Pro高达20%-30%，如果将此区域与各种DNA结合结构域相连便可激活转录过程，其他哺乳类动物的转录因子如Ap-2、Jun、Oct-2、SRF中也有此类激活结构。激活结构域可能是转录因子与其他蛋白质相接触的区域。

聚合酶II在转录起始时至少需要5—6种转录因子，转录因子之间的相互作用如何，目前还不太清楚.。第三十二页，共九十三页，2022年，8月28日4、RNA的编辑编辑（editing）是指转录后的RNA在编码区发生碱基的突变、加入或丢失等现象。第三十三页，共九十三页，2022年，8月28日C变为U碱基的突变第三十四页，共九十三页，2022年，8月28日尿苷酸的缺失和添加在研究锥虫线粒体mRNA转录加工时发现mRNA的多个编码位置上加入或丢失尿苷酸，1990年在高等动物和病毒中也发现了编辑现象。第三十五页，共九十三页，2022年，8月28日锥虫coxII基因的编辑第三十六页，共九十三页，2022年，8月28日第三十七页，共九十三页，2022年，8月28日核酶核酶（ribozyme）是指一类具有催化功能的RNA分子通过催化靶点RNA链中的磷酸二酯键的断裂，特异性地剪切底物RNA分子，从而阻断基因表达。核酶的几种特殊结构：锤头状结构、I类内含子结构、二类内含子结构等第三十八页，共九十三页，2022年，8月28日Hammer–headStructure1.锤头结构核酶及作用机制锤头结构核酶结构特点：1）由11-13个保守核苷酸组成催化中心。2）H为切割位点（H为除G外任意核苷酸）。切割部位遵循NUH原则。3）颈环III可以不是环状结构第三十九页，共九十三页，2022年，8月28日锤头结构的五种类型R表示酶；S表示底物；箭头表示剪切位点第四十页，共九十三页，2022年，8月28日纺锤头结构作用机制核酶和含有剪切位点的底物共同组成锤头结构，底物部分是切割部位两端的核苷酸，与核酸酶茎I和茎III结合。切割后，该底物被释放。一个新的没有被切割的底物继续结合上去，使切割反应不断重复进行。第四十一页，共九十三页，2022年，8月28日●RNA的种类与功能●基本概念●原核生物的转录●真核生物的转录●原核生物与真核生物mRNA的特征比较●RNA合成与DNA合成异同点Contents第四十二页，共九十三页，2022年，8月28日6.1.2真核基因表达调控的环节第四十三页，共九十三页，2022年，8月28日6.2真核生物的DNA水平调控

6.2.1基因丢失在原生动物、昆虫等生物的细胞分化过程中有染色体丢失的现象，马蛔虫受精卵有2条染色体，当个体发育到一定阶段，分化为体细胞的那些细胞中的染色体断裂为小的片段，有着丝点的小片段保留下来，其他的不能分配到下一代而失去，基因的丢失决定了细胞的寿命。但在高等生物的细胞分化中没有此现象。第四十四页，共九十三页，2022年，8月28日6.2.2基因扩增即基因组中的特定段落在某些情况下会复制产生许多拷贝。最早发现的是蛙的成熟卵细胞在受精后的发育过程中其rRNA基因(可称为rDNA)可扩增2000倍，以后发现其他动物的卵细胞也有同样的情况，这很显然适合了受精后迅速发育分裂要合成大量蛋白质，需要有大量核糖体。又如MTX(methotrexate)是叶酸的结构类似物，一些哺乳类细胞会对含有利用叶酸所必需的二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase,DHFR)基因的DNA区段扩增40?00倍，使DHFR的表达量显著增加，从而提高对MTX的抗性。基因的扩增无疑能够大幅度提高基因表达产物的量，但这种调控机理至今还不清楚。第四十五页，共九十三页，2022年，8月28日6.2.3基因重排即胚原性基因组中某些基因会再组合变化形成第二级基因。例如编码完整抗体蛋白的基因是在淋巴细胞分化发育过程中，由原来分开的几百个不同的可变区基因经选择、组合、变化，与恒定区基因一起构成稳定的、为特定的完整抗体蛋白编码的可表达的基因。这种基因重排使细胞可能利用几百个抗体基因的片段，组合变化而产生能编码达108种不同抗体的基因，其中就有复杂的基因表达调控机理。6.3真核基因转录水平的调控真核基因的转录与染色质的结构变化相关

DNA绝大部分都在细胞核内与组蛋白等结合成染色质，染色质的结构影响转录，至少有以下现象：第四十六页，共九十三页，2022年，8月28日1、染色质结构影响基因转录细胞分裂时染色体的大部分到间期时松开分散在核内，称为常染色质(euchromatin)，松散的染色质中的基因可以转录。

染色体中的某些区段到分裂期后不像其他部分解旋松开，仍保持紧凑折叠的结构，在间期核中可以看到其浓集的斑块，称为异染色质(heterochromatin)。（1）异染色质中从未见有基因转录表达；（2）原本在常染色质中表达的基因如移到异染色质内也会停止表达；例：哺乳类雌体细胞2条X染色体，到间期一条变成异染色质者，这条X染色体上的基因就全部失活。

可见紧密的染色质结构阻止基因表达。第四十七页，共九十三页，2022年，8月28日2、组蛋白的作用早期体外实验观察到组蛋白与DNA结合阻止DNA上基因的转录，去除组蛋基因又能够转录。（1）组蛋白是碱性蛋白质，带正电荷，可与DNA链上带负电荷的磷酸基相结合，从而遮蔽了DNA分子，妨碍了转录；（2）染色质中的非组蛋白成分具有组织细胞特异性，可能消除组蛋白的阻遏，起到特异性的去阻遏促转录作用。

3、DNA拓扑结构变化天然双链DNA的构象大多是负性超螺旋。当基因活跃转录时，RNA聚合酶转录方向前方DNA的构象是正性超螺旋，其后面的DNA为负性超螺旋。（1）正性超螺旋会拆散核小体，有利于RNA聚合酶向前移动转录；（2）而负性超螺旋则有利于核小体的再形成。

第四十八页，共九十三页，2022年，8月28日4、转录活跃区域对核酸酶作用敏感度增加

染色质DNA受DNaseⅠ作用通常会被降解成400bp左右的片段，反映了完整的核小体规则的重复结构。（1）但活跃进行转录的染色质区域受DNaseⅠ消化常出现100－200bp的DNA片段，且长短不均一，说明其DNA受组蛋白掩盖的结构有变化，出现了对DNaseⅠ高敏感点(hypersensitivesite)。（2）这种高敏感点常出现在转录基因的5′侧区(5′flankingregion)、3′末端或在基因上，多在调控蛋白结合位点的附近。分析该区域核小体的结构发生变化，可能有利于调控蛋白结合而促进转录。第四十九页，共九十三页，2022年，8月28日5、DNA碱基修饰变化真核DNA中的胞嘧啶约有5%被甲基化为5-甲基胞嘧啶(5-methylcytidine,m5C)，而活跃转录的DNA段落中胞嘧啶甲基化程度常较低。

这种甲基化最常发生在某些基因5′侧区的CpG序列中。

实验表明这段序列甲基化可使其后的基因不能转录，甲基化可能阻碍转录因子与DNA特定部位的结合从而影响转录。第五十页，共九十三页，2022年，8月28日6.4真核基因翻译水平的调控本节重点——真核生物mRNA5’末端结构对翻译的影响。——真核生物mRNA3’末端结构对翻译的影响。

翻译过程主要涉及到细胞的四种装置：(1)核糖体，它是蛋白质生物合成的场所；(2)mRNA，它是蛋白质生物合成的模板;(3)tRNA，它是氨基酸的携带者；(4)可溶性蛋白因子，它是蛋白质生物合成的起始物所必需的因子。可溶性蛋白因子种类繁多，按功能可分为三类：一是起始因子，如eIF-2、eIF-2B，eIF-3，eIF-4A，eIF-4F，eIF-5等；二是延伸因子，如EFl，EF2等；三是终止因子，如RF等。第五十一页，共九十三页，2022年，8月28日6.4.1可溶性蛋白因子的修饰与翻译起始的调控

研究发现，对许多可溶性蛋白因子的修饰也会影响翻译起始。1、肽链起始因子eIF-2在激酶的作用下发生磷酸化，可以抑制蛋白质的合成。例如：用兔网织红细胞粗抽提液研究蛋白质的合成时发现，（1）如果不向这—体系中添加氯高铁血红素，几分钟之内蛋白质的合成活性将急剧下降，直到消失。即，当没有氯高铁血红素存在时，兔网织红细胞粗抽提液中的蛋白质合成抑制剂HCl将被活化。（2）现已查明，该抑制剂是受氯高铁血红素调节的，它其实是eIF-2的激酶，可以使eIF-2的a亚基磷酸化，由活性型变成非活性型，而没有生物学活性的HCl也可以通过自身的磷酸化变成活性型。第五十二页，共九十三页，2022年，8月28日（3）氯高铁血红素能够阻断HCl的活化过程，但作用机制尚不清楚。（4）eIF-2发生磷酸化后不影响其与GTP及Met-tRNA形成中间复合物，同时也不阻碍40S和80S起始复合物的形成，但它主要抑制eIF-2B催化GDP/GTP的交换反应，以致使eIF-2不能产生，由此，没有eIF-2进入中间复合物的再循环，导致翻译的终止。2、酵母eIF-2磷酸化对GCN4mRNA翻译起始有激活作用。（1）GCN4是一转录因子，特异性地结合在一些氨基酸合成酶基因启动子的TGACTC上。（2）在5’端除了有起始密码子外，在前端还有4个上游开放的阅读框，每个都有起始密码子，但GCN4是从第五个开始翻译，上游的起始密码子对下游的翻译有抑制效应。第五十三页，共九十三页，2022年，8月28日（3）在非饥饿条件下，eIF-2处于正常水平，上游的阅读框翻译完成后，释放的核糖体随即向下游的阅读框滑动，并启动翻译，而GCN4的翻译被阻止。（4）在饥饿条件下，细胞处于应急状态，eIF-2磷酸化，活化型eIF-2的减少，翻译起始复合物的再循环必然受到限制，因此上游的阅读框（1号）翻译后释放的核糖体加速滑动，很快穿过其他的阅读框，而结合于第五个起始密码子处，开始翻译。第五十四页，共九十三页，2022年，8月28日6.4.2mRNA的“扫描模式”与蛋白质合成的起始1、真核生物蛋白质合成起始的“扫描模式”（Kozak）：在真核生物起始蛋白质的合成时，40S核糖体亚基及有关的合成起始因子首先与mRNA模板靠近5’末端处结合，然后向3’方向滑行，发现AUG起始密码子时再与60S大亚基结合，形成80S起始复合物。（1）40S起始复合物总是在碰到第一个AUG时就停下来，并在这里与60S亚基结合，形成第一个肽键。也就是说，只有最接近mRNA5’末端的读码框才能被翻译。

注意：真核生物mRNA的这种特性与其说是由mRNA的结构决定的，不如说是由真核生物核糖体的性质所决定的。

第五十五页，共九十三页，2022年，8月28日

实验1：如果将大肠杆菌或小麦胚的核糖体与1噬茵体的多聚顺反子（它具有类似于真核mRNA的5’帽子结构）一起保温，会发现在大肠杆菌核糖体中，多聚顺反子的第一个和第二个AUG都能顺利起始蛋白质的合成，而小麦胚核糖体只能以第一个AUG作为起始位点。实验2：有人将大肠杆菌gal操纵子的多聚顺反子（它也有5’帽子结构）放入真核生物无细胞蛋白质合成体中，发现它虽然也能被翻译，但是只读了5’末端的第一个读码框。从这些实验可以看出，真核生物细胞的核糖体并不直接结合于mRNA内部的起始密码，所以在读完第一个读码框之后并不能接下去读第二个。第五十六页，共九十三页，2022年，8月28日（2）为什么核糖体滑行到mRNA的第一个AUG，即在离5’末端最近的起始密码子位点就停下来，并起始翻译呢?

现在认为，这是由AUG的前后序列所决定的。a.在调查了200多种真核生物mRNA5’末端第一个AUG的前后序列后发现，除有17个例外之外，其余都是A/GNNAUGG，说明这样的序列对翻译起始来说最为合适。b.如果从mRNA5’末端向3’端移动的40S起始复合物碰到了第一个AUG，而且这一AUG又处在最合适的前后序列中，核糖体小亚基就在这里与60S亚基会合，并开始合成蛋白质。注意：mRNA的“扫描模式”相当合理地说明了许多真核生物mRNA的单一顺反子性质。第五十七页，共九十三页，2022年，8月28日6.4.3mRNA5’末端帽子结构的识别与蛋白质合成

第五十八页，共九十三页，2022年，8月28日1、帽子的类型和功能（1）第一个甲基出现在所有的真核细胞mRNA中（单细胞真核mRNA主要是这种结构），由鸟苷酸-7-甲基转移酶催化，称为O帽子（capO）。（2）帽子结构的下一步是在第二个核苷酸（原mRNA的第一位）2’-OH位上加上另一个甲基，我们把有这两个甲基的结构称为I类帽子（capl）。真核生物mRNA中以这类帽子为主。（3）在某些生物细胞内，mRNA链上的第三个核苷酸的2’-OH位也可能被甲基化，因为这个反应只以I类帽子为底物，所以被称为Ⅱ类帽子（capⅡ），有这类帽子的mRNA只占有帽RNA总量的10~15％以下。第五十九页，共九十三页，2022年，8月28日2、帽子结构与mRNA的合成效率之间关系十分密切，下述证据可以说明这一点：(1)帽子结构是前体mRNA在细胞核内的稳定因素，也是mRNA在细胞质内的稳定因素，没有帽子的转录产物将很快被核酸酶所降解；(2)帽子可以促进蛋白质生物合成起始复合物的生成，因而提高了翻译强度；(3)没有甲基化的帽子以及用化学或酶学方法脱去帽子的mRNA，其翻译活性显著下降；(4)帽子结构的类似物，如m7GMP，m7GDG和m7G（5’）等都能强烈抑制有帽子mRNA的翻译，但对没有帽子mRNA的翻译没有影响。第六十页，共九十三页，2022年，8月28日

例如：大鼠有两个等量表达的胰岛素基因，可生产出等量的胰岛素1和胰岛素2。但在b肿瘤细胞中这一平衡被打破了，胰岛素1的产量为胰岛素2的10倍左右。研究表明，此时胰岛素2的mRNA失去了5’帽子，因此抑制了它作为模板合成蛋白质的过程。大鼠胰岛素基因的表达调控，充分说明了帽子结构对蛋白质合成的重要性。第六十一页，共九十三页，2022年，8月28日6.4.4反义RNA对翻译的调控作用前面我们已经讲了反义RNA对原核基因翻译水平的调控。天然反义RNA首先在原核细胞中发现，近年来，在真核生物中也发现了一些可能的天然反义RNA。例如禽类C-myc基因可反向不连续地转录出三个反义RNA，分别位于第一外显子上游，第一内含子、第二内含子和第三外显子之间，推测它可与mRNA互补，参与翻译调控。

在蛋白质的生物合成过程中，特别是在起始反应中，mRNA的“可翻译性”是起决定作用的，其5’末端的帽子结构、二级结构与rRNA的互补性，以及起始密码附近的核苷酸序列都是蛋白质生物合成的信号系统。蛋白质生物合成的调控，就是通过mRNA本身所固有的这些信号与可溶性蛋白因子或者与核糖体之间的相互作用而实现的。第六十二页，共九十三页，2022年，8月28日6.4.5mRNA3′---UTR(untranslatedregion)1、控制mRNA的降解在许多哺乳动物和酵母的mRNA的降解过程中，去除ploy(A)是首要的关键的一步，ploy(A)尾部的缩短率由位于编码区内的顺式作用元件所调节，存在于许多高度不稳定的哺乳动物的mRNA3′---UTR内的AU富集元件就是一个常见的序列，它介导mRNA的降解，是决定mRNA稳定性的重要因素。对mRNA3′---UTR的保守序列介导的mRNA的降解的机制目前所知较少，但有人提出AU富集元件介导的降解的一般模式可能有普遍意义。

AU富集元件结合蛋白及其辅助因子与靶序列结合，激活去ploy(A)，形成中间体，最终由核酸内/外切酶降解，从而使mRNA得以更新。第六十三页，共九十三页，2022年，8月28日2、介导翻译调控（1）体内蛙卵母细胞和体外网织红细胞抽提物实验表明带有ploy(A)尾的mRNA的翻译频率明显高于脱尾的mRNA，ploy(A)尾对翻译的影响与其长度成正比关系，当少于20个碱基时，mRNA的活性迅速降低。（2）ploy(A)促进翻译还必须有与其结合的蛋白(ploy(A)结合蛋白），ploy(A)与ploy(A)结合蛋白结合形成的复合物对翻译起始复合物的形成有重要的作用，但几具体机制仍不明确。（3）此外，此尾部结构与mRNA的稳定性有关，也与病毒的侵染有关。

第六十四页，共九十三页，2022年，8月28日mRNA3′---UTR中的某些元件与蛋白因子相互作用而调控翻译，果蝇的性状决定基因mRNA的翻译有赖于它们在胚胎细胞前后轴上的定位，此定位是由mRNA3′---UTR所决定；在小鼠精子的发生过程中，精蛋白mRNA由转录形成后，需在精原细胞细胞质内储藏3到7天才被翻译，这是由精蛋白的mRNA3′---UTR所控制的；所有这些研究表明mRNA3′---UTR不仅调控翻译产物，而且控制翻译发生的时间、地点。

3、控制某些特殊遗传密码的辨认在密码子表中没有密码与硒代半胱氨酸对应，在真核生物中，硒代半胱氨酸由位于mRNA编码框内的UGA密码子所编码，而它在一般情况下是终止密码子，此时，它所编码的罕见氨基酸的功能就是由mRNA3′---UTR内的硒代半胱氨酸插入序列所指导的。第六十五页，共九十三页，2022年，8月28日4、终止密码子的选用研究表明，通用的终止密码子虽然有三个，但是，它们在不同的真核生物中出现的频率是不同的，脊椎动物和单子叶植物中使用频率最高的是UGA,其他真核生物中主要使用UAA,而UGA的使用频率最低，终止密码子的选用与mRNA中GC的含量有关，赖氨酸的密码子AAG经常出现在终止密码子的5′端位置，但其作用不明。5、UA序列的作用

UA序列是终止密码子与polyA之间的非编码区的一部分保守序列，一些细胞因子（生长因子）的mRNA3′UTR中含有相间分布的UUAUUUAU8核苷酸组成的保守序列，UA序列是蛋白质翻译的终止的协同信号，又是抑制翻译起始的元件，UA序列作为一些低效起始因子的结合元件，通过再与起始复合物相互作用而抑制翻译，其抑制效率随其在mRNA3′UTR中拷贝数的增加而增高，但他抑制的步骤仍不清楚。第六十六页，共九十三页，2022年，8月28日6.4.6mRNA稳定性

mRNA的稳定性也就是其寿命，原核生物的mRNA寿命较短，半衰期约为3分钟，高等真核生物的细胞中mRNA的半衰期平均为3小时。寿命的长短除决定与其内在因素（如二级结构）外，还与转录后的修饰有关，而且不同的mRNA会与不同的蛋白质结合形成mRNP，mRNA寿命的长短可改变细胞内某种mRNA的浓度，因而改变了蛋白质的合成速度。1、mRNA5′帽子结构与mRNA的稳定性绝大多数真核生物的mRNA5′有帽子结构，可以增加mRNA的稳定性，保护其免遭核酸外切酶的攻击，帽子结构是前体mRNA在细胞核内稳定的因素，同时也是在细胞质内稳定的因素。第六十七页，共九十三页，2022年，8月28日2、mRNA3′poly(A)与mRNA的稳定性

mRNA3′poly(A)的长度一般为40---200个碱基，在转录后加上poly(A)短的mRNA的寿命也短。实验：若用大肠杆菌的多核苷酸酶处理珠蛋白的mRNA，除掉poly(A），然后将有poly(A）和没有poly(A）的两种mRNA分别注射入非洲爪蟾的卵母细胞，观察他们合成珠蛋白的能力，发现：（1）在注射后30到40分时，利用二者合成蛋白质基本无差异；（2）但在1小时后，没有poly(A）尾部的mRNA合成的蛋白质急剧减少；（3）到56小时，有poly(A）的合成蛋白质的能力还维持相当水平，但无尾部的蛋白合成能力只有15%。第六十八页，共九十三页，2022年，8月28日

此实验很好地说明mRNA3′poly(A）的存在提高了mRNA的稳定性，因而也提高了蛋白质的合成总量。

另外，研究表明，poly(A）对mRNA稳定性作用还需要poly(A）结合蛋白的参与，一旦，poly(A）结合蛋白与poly(A）分开，mRNA3′暴露，容易引起降解；最近的研究表明poly(A）对翻译有激活作用在于促进80S的核糖体翻译起始物的形成，是通过与60S亚基的相互作用实现的。

第六十九页，共九十三页，2022年，8月28日6.4.7mRNA5′---UTR1、帽子的功能主要有：（1）增强翻译效率的作用，只有甲基化的帽子结构才能使mRNA有效翻译，（2）还有利于mRNA从细胞核转运到细胞质。（3）增加mRNA的稳定性，（4）与mRNA3′尾部协同翻译效率。2、起始密码子与翻译的起始对大多数核糖体来讲，只要第一个AUG的-3位为A，即可满足从此开始翻译。对于高等生物而说，在上游还有多个AUG，翻译并不是从第一个开始。第七十页，共九十三页，2022年，8月28日3、AUG旁侧序列与翻译的起始效率（1）一般而言，-3位为A和-4位为G，对AUG的识别有促进作用。（2）与AUG前导序列的长度有关，利用不同长度的mRNA5′---UTR，表明长度在17—80个核苷酸是，翻译效率与长度成正比，结构过短，则核糖体不识别AUG，会滑落下去。4、mRNA5′---UTR二级结构对翻译的影响一般说来，mRNA5′---UTR二级结构对翻译有抑制效应，当AUG距帽子有12个nt，由于位阻，阻挡了40S小亚基起始因子与mRNA的结合，导致翻译不能开始。当AUG距帽子有50个nt，则不影响它们的结合，对翻译有促进作用。在AUG下游14nt形成二级结构，增强翻译起始效率。第七十一页，共九十三页，2022年，8月28日

综上所述，对于有效翻译必须有一个适当的长度的高级结构区，否则翻译会受影响。而对于富含G+C或者富含AUG的复杂的二级结构，不论长度多少，对翻译均为抑制作用。第七十二页，共九十三页，2022年，8月28日6.5翻译后水平调控真核生物的基因经过转录及转录后加工、mRNA的修饰、蛋白质合成等生化过程生成基因产物后，基因表达的任务还不算最终完成。这是因为初生的原始状态的蛋白质大多是没有生物学活性的，必须经过一系列的加工才能成为有活性的蛋白质。翻译后加工主要包括多肽的切割、剪接与修饰等。

6.5.1多肽的切割6.5.2多肽的剪接和化学修饰第七十三页，共九十三页，2022年，8月28日6.5.1多肽的切割多肽的切割主要有两个内容，一是与蛋白质分泌有关的切割，二是与蛋白质活化有关的切割。蛋白质的合成是在核糖体中进行的，核糖体根据DNA转录的mRNA翻译成各种蛋白质。细胞质中的核糖体主要有以下两类：一类附着于膜上，主要是内质网（ER）膜和线粒体内膜，参与清蛋白、胰岛素等分泌蛋白的合成；另一类游离于胞质中，主要参与细胞固有蛋白的合成。在部分细胞中，核糖体上所合成的蛋白质要从内质网进入高尔基体，在高尔基体中浓缩成酶原小粒并贮藏起来，直到分泌出去为止。人们发现，如果将某些分泌蛋白质的mRNA在麦胚无细胞体系中进行翻译，其产物的分子量要比预期的大得多。例如，胰岛素由51个氨基酸残基组成，在兔网织红细胞体系中的翻译产物为86个氨基酸残基组成的胰岛素原，但在麦胚无细胞体系中的翻译产物则为约由110个氨基酸残基组成的前胰岛素原。这类分泌蛋白质有一个特点，就是在它们的N端都有一段可称为信号肽的小肽，这种带有信号肽的蛋白质称为前蛋白。前蛋白必须在切除信号肽之后才具有生物活性。第七十四页，共九十三页，2022年，8月28日1、信号肽的切割（1）信号肽假说（Signalpeptidehypothesis）信号肽假说是Blobel和Dobberstein于1975年首先提出的。该假说认为，穿膜蛋白质是由mRNA编码的。在起始密码子之后，有一段编码疏水性氨基酸序列的RNA片段，这个氨基酸序列就称为信号序列。信号序列在结合核糖体上合成后，便与膜上的特定受体相互作用，在内质网膜(EndoplasmicReticulumER)中形成孔道，使生长中的肽链穿过内质网膜进入内质网腔中，而存在于内质网内腔壁上的信号肽酶可将信号肽切下。早在1972年就有研究发现，免疫球蛋白（1gG）轻链可能是以“前体”形式合成的，其N端比成熟蛋白多一段由20个氨基酸残基组成的多肽，推测该多肽具有信号作用，能使1gG蛋白得以顺利穿越内质网膜并分泌到细胞外。

第七十五页，共九十三页，2022年，8月28日主要有三个方面的研究支持上述设想：

a.当IgG轻链的mRNA在无细胞体系内被翻译时，在没有内质网存在的情况下将产生IgG轻链的前体；如果在翻译时加入内质网，就能得到成熟的IgG轻链；

b.加入蛋白水解酶并不能使合成的IgG轻链水解，但若同时加入去垢剂，IgG蛋白就能被水解，暗示IgG的合成伴随跨膜转运过程；

c.用去垢剂处理多核糖体使之与膜分离，然后进行体外新生肽合成实验，发现短时温育可得到成熟型的IgG轻链，而较长时间温育则得到IgG轻链的前体，这表明位于mRNA5’端的核糖体携带了尚未进行加工的新生肽，而邻近3’端的核糖体则带着已加工的新生肽，从而证实信号肽的分解是与翻译过程同时发生的。第七十六页，共九十三页，2022年，8月28日（2）信号肽的结构特点信号肽在结构上具有以下特点：

a.信号肽的氨基端至少含有一个带正电荷的氨基酸，为一亲水区段。不同信号肽的亲水区段所含氨基酸残基的多少不同，从而造成信号肽长短不齐，但其长度通常为1~7个AA。

b.信号肽的中部有10~15个氨基酸，是由高度疏水性的氨基酸组成的肽链。常见的氨基酸有Ala、Leu、Ile、Val、Phe等。该疏水区很重要，其中某一个氨基酸被极性氨基酸置换便可使信号肽失去功能。该区段长5.5nm，以侧链较短的氨基酸（如G1y、Ala）结尾，其结尾的氨基酸恰好在信号肽酶的切点之前。

c.信号肽的C末端有一个可被信号肽酶识别的位点，此位点上游的第一个(1)及第三个(3)氨基酸常为具有一个小侧链的氨基酸(如Ala)。

d.信号肽无同等性及专一性。各种分泌蛋白质的信号肽在顺序上并未发现有同等性，也未发现信号肽存在于已完成的多肽上。信号肽也无严格的专一性，表现在信号肽对所输送蛋白质结构的要求不严格，例如，大鼠前胰岛素原如果接上真核细胞或原核细胞的信号肽，也能通过大肠杆菌的质膜分泌到胞外，甚至在信号肽的氨基端额外连接着18个氨基酸残基时也仍可以输出。第七十七页，共九十三页，2022年，8月28日（3）信号识别蛋白和对接蛋白

a.信号识别蛋白(或信号识别颗粒，signalrecognitionparticle，SRP)

蛋白质在体内的合成速度极快，信号肽段一旦在核糖体上伸出，必须在几秒钟内固定在内质网膜上，这是因为肽链的加长会形成二级结构，妨碍信号肽与酶的结合。研究发现，细胞内存在着信号肽的一种识别颗粒，在核糖体上刚露出信号肽段时，该识别颗粒就可以与此核糖体上的信号肽结合，阻断此种分泌蛋白的合成，使mRNA与核糖体的复合体有足够的时间找到内质网膜。现在已知识别颗粒是由六条多肽链（分子量分别为72、68、54、19、14、9KD）和7SRNA构成的核糖核酸蛋白体复合体。b.对接蛋白（dockingprotein，DP）

1982年，Meyer等人发现内质网膜上存在着一种“对接蛋白”，又称停靠蛋白或识别颗粒受体蛋白。它是一种内在膜蛋白，由单个多肽链的650个氨基酸残基组成，分子量为72KD。对接蛋白可使SRP-信号肽-新生肽链-核糖体复合物结合到内质网膜上，解除SRP对核糖体合成肽链的抑制。当它们结合后，核糖体又恢复新生肽链的延长，随后，新生肽链紧跟信号肽伸入内质网腔，信号肽被水解，形成“成熟型蛋白质”（主要是分泌蛋白、溶酶体蛋白和膜蛋白）。这时核糖体也离开膜，分成大、小两个单位游离在胞质溶液中，准备下一个循环。最后多肽链的C端也进入内质网腔。N末端的信号肽SRP和它的受体（对接蛋白）仅在开始转运新生肽链时结合在一起，随后SRP从核糖体-新生肽链复合体上分离下来，又回到胞质中准备下一个循环。第七十八页，共九十三页，2022年，8月28日

（4）信号肽受体和核糖体受体在真核生物中信号肽可识别内质网膜上的一种蛋白质，即信号肽受体，并与之结合，使膜上形成一个孔眼或隧道。内质网膜上还存在核糖体受体，当核糖体与其相应的受体结合时，可加固上述孔眼或隧道。（5）信号肽酶

真核生物的信号肽酶位于内质网内膜上。新生的肽链通过孔眼进入内质网腔以后，信号肽酶可切除信号肽段。对于多数蛋白质，信号肽段的切除是在多肽链已合成到80%以上时才开始进行的。第七十九页，共九十三页，2022年，8月28日（6）翻译协同分泌如上所述，大多数蛋白质在合成时即开始其穿越生物膜的过程，这就是所谓的与翻译偶联的分泌——翻译协同分泌。在真核生物中，以胰岛素的分泌为例，可将翻译协同分泌的具体过程归结如下：分泌蛋白质新生多肽链的信号肽段在核蛋白体上出现后，识别颗粒便使翻译暂停，使该核蛋白体有足够时间找到内质网膜。信号肽段与内质网膜上的受体结合的同时，核糖体60S亚基也与内质网膜上的核糖体受体结合，此时对接蛋白去除识别颗粒，使翻译继续进行。信号肽与其受体结合后，使内质网膜形成孔道，核糖体与其受体结合后，可加固此孔道，信号肽段即可突入此孔道，进入内质网的内腔。内质网的内腔壁上有信号肽段酶，通常在多肽链全链合成80%以上时将信号肽段切下（此时前胰岛素原转变成胰岛素原）。信号肽段切下后，肽链本身继续增长，直至合成终止。多肽链合成完成后，多肽链(胰岛素原)释下，全部进入内质网腔，在内质网腔中由内质网的RER面向SER面移动，最后进入高尔基体（Golgibody），在高尔基体中经过进一步加工后（由胰岛素原成为胰岛素）储存于分泌小泡。最后，分泌小泡与质膜融合，形成出口，分泌蛋白(胰岛素)即可排出胞外。第八十页，共九十三页，2022年，8月28日第八十一页，共九十三页，2022年，8月28日2、多肽的水解加工（1）胰岛素原（proinsulin）的加工在哺乳动物细胞内合成结束时，前胰岛素原就转变为胰岛素原。在内质网腔中形成的胰岛素原可被运送到高尔基体，经加工，切去连接肽段，即成为胰岛素，储于分泌小泡。这些小泡可与质膜融合，形成出口，将胰岛素排出胞外。已合成好的胰岛素原为一条肽链，这条肽链由84个氨基酸残基组成，存在三个-S-S-键。在酶的作用下整个肽段被切三段，去掉由33个氨基酸组成的肽段（这一段有掩盖胰岛素活性的作用），余下的部分即为由两条肽链构成的有活性的胰岛素。其中，A链为原羧基端所在肽链，含21个氨基酸；B链为原氨基端所在肽链，含30个氨基酸。第八十二页，共九十三页，2022年，8月28日第八十三页，共九十三页，2022年，8月28日（2）纤维球蛋白原的加工纤维球蛋白原是由、和这三种肽链各两条所组成的蛋白质。其中和链都有一个“中央突出”，妨碍了纤维球蛋白分子之间的聚合。经过蛋白水解酶的作用，切去这些突起的部位后，三个多肽才能紧密聚合在一起，形成不溶性的纤维球蛋白。这种由纤维球蛋白原变成纤维球蛋白的过程，就是血液凝固的最后阶段中所发生的生物化学反应。血液凝固的过程其实是不同蛋白质因子经有限水解不断被活化的过程。血凝因子原来以非活性形式存在，当血液流出血管表面（伤口处）时，非活性的XIII因子被活化。这些因子又使前凝血酶原和纤维球蛋白原活化，产生不溶性纤维球蛋白，使血液凝固。第八十四页，共九十三页，2022年，8月28日6.5.2多肽的剪接和化学修饰1、多肽的剪切初生蛋白质接受切割、有限水解或化学修饰而成为有活性的成熟蛋白质，这就是蛋白质活化的主要机制。近年来，不少科学家还发现，蛋白质前体可以通过多肽的剪辑被切成数个片段，然后再以一定的顺序结合起来，最后形成成熟的有活性的蛋白质。具有这种加工机制的蛋白质包括红细胞凝集素、T细胞的促细胞分裂剂、豆类植物的凝集素和伴刀豆球蛋白等。例：伴刀豆球蛋白：实际上是以混合物的形式存在于成熟的大豆种子中，其中“诱导型”伴刀豆蛋白是一个四聚体，相对分子质量为1.0×l05，由4条含237个氨基酸的肽链构成；

“分裂型’伴刀豆球蛋白是断裂型多聚体，相对分子质量为5.0×104，每条肽链在第118位的天冬酰胺与119位的丝氨酸之间被切断。第八十五页，共九十三页，2022年，8月28日

研究编码这些蛋白的基因序列发现，伴刀豆蛋白前体可由五部分组成，即：信号肽（由29个氨基酸组成）、成熟伴刀豆球蛋白的C末端（第119~237位氨基酸）、连接肽（含15个氨基酸）、成熟伴刀豆球蛋白的N末端（1~118位