内容教案cdna合成

为了准确地进行表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但TotalRNA中常常混有组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果确。为了避免这种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使组DNA得不到扩增。但是，此方方法。在这种情况下，我们常常需要对TotalRNA样品进行DNaseI处理，以除去残存的组DNA。而DNaseI处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser是可以除去组DNA进行RealTimeRT-PCR反应的反转录试剂。Kit中使用了具有较强DNA分解活性的gDNAEraser，通过42℃，2min即可除去组DNA。同时由于反转录试剂中含有抑制DNA的组分，经过gDNAEraser以直接进行15min的反转录反应合成cDNA，因此，20分钟内即可迅速完成从组DNA去除到cDNA合成使用本制品合成的cDNA适用于SYBR®Green分析法和TaqMan®探针分析法，可以根据实验目的，选择与SYBR®PremixExTaqTMII（PerfectRealTime）、PremixExTaqTM（PerfectRealTime）等TaKaRaPerfectRealTime系列定量试剂组合使用。制品内容（20l反应×100次gDNA 5×gDNAEraser PrimeScript®RTEnzymeMix 5×PrimeScript®Buffer2（forReal RTPrimer RNase 1ml×2EASYDilution（forRealTime 1*15×gDNAEraserBuffer在反转录反应前使用，请务必进行组DNA的除去反应*2含有RNaseInhibitor*3含有dNTPMixture*4含有OligodTPrimer和Random6mers*5制作标准曲线时梯度稀释cDNA或RNA品的稀释液。模板DNA或RNA如果用水或TEBuffer稀释时，由于受Microtube吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验结果精度降的标准曲线。EASYDilution也可以单独（TaKaRaCode：D9160）。EASYDilution与本公RealTimePCR剂组合使用，对于其他公司的同类制品的适用性本公 存：-20℃特长含有去除组DNA的gDNAEraser，只需2min即可除去组DNA只需15min即可高效合成RealTimePCR反应用模板cDNA，是进行2StepRealTimeRT-PCR反应反转录引物使用了Random6mers和OligodTPrimer混合的RTPrimerMix，可以均匀合成样品中的各种cDNA。本制品提供了SYBRGreen分析法和TaqMan探针分析法各自最适反应体系，可以根据分析方法选择制品中附加了标准曲线制作用稀释液EASYDilution（forRealTimePCR），将TotalRNA或cDNA稀RNA样品本制品是将RNA反转录成cDNA的试剂。RNA的纯度会影响cDNA的合成量，而RNA的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴干净手套；使用RNA操作实验台；在操作过程中避免等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。（1）干热灭菌（180℃，60（2）用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。实验用于RNA实验的试剂，需使用干热灭菌（180℃，60min）或用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可使用RNA实验用的塑料容器），使用的无菌水需用0.1%的DEPC处理后进行高【方法使用简单的RNA纯化方法即可获得满足于RT-PCR反应的RNA（只需少量的RNA便可进行RT-反应。但为了保证实验的成功率，建议使用GTC法（异硫酸胍法）的高纯度RNA。从培养细胞、组织中提取时，使用RNAisoPlus（TaKaRaCode:D9108）。当同时需要进行数次反应时，应先配制各种试剂的混合液（MasterMix；其中包括RNasedH2O、gDNAEraser和PrimeScript®RTEnzymeMixI在使用前要地离心收集到反应管底部。由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。同时，要使用精确、量程适合的移液枪，并且不要5×gDNAEraserBuffer和5×PrimeScriptBuffer2（forRealTime）在使用前需Vortex轻轻离心将得到的RT反应液加入到下一步的RealTimePCR反应体系中，其加入量不要超过RealTime反应体积的1/10（V/V）量【SYBR®GreenAssay①组DNA的除去反应5×gDNAEraserBuffergDNAEraser2.01.0TotalRNaseupto10②反转录反应

2min（或者室温5min*2）制MasterMix，然后再分装到每个反应管中*3。5×PrimeScript®Buffer2（forReal4.0PrimeScript®RTEnzymeMixIRTPrimerMix*41.01.010.0RNaseupto20 15 5*120μl应体系可最大1μg的TotalRNA*2室温反应时，可以延长至30钟*3不配制MasterMix，向①的反应液中添加试剂时要先加入RNasedH2O和5×PrimeScriptBuffer2(forRealTime)，混合后再添加RTPrimerMix、PrimeScriptRTEnzymeMixI，轻轻混*4使用RTPrimerMix可以高效合成cDNA。因为实验目的不同，也可以不使用RTPrimerMix，而选择OligodTPrimer或GeneSpecificPrimer进行反转录反应，引物使用量如下：OligodTPrimer50pmol／20μl反应GeneSpecificPrimer5pmol／20μl反应反转*6使用GeneSpecificPrimer时，建议反转录反应条件设置为42℃15min。PCR反应有非特异性扩增时，将温度升到50℃会有所改善。*7合成的cDNA请于-20【TaqMan®ProbeAssay①去除组DNA反应5×gDNAErasergDNA2.01.0TotalRNaseupto10 2min（或者室温5min*2）②反转录反应制MasterMix，然后再分装到每个反应管中*3。5×PrimeScript®Buffer2（forReal4.0PrimeScript®RTEnzymeMix1.0RTPrimerMix4.010.0RNaseupto20 15 5*120μl应体系可最大2μg的TotalRNA*2室温反应时，可以延长至30钟*3不配制MasterMix，向①的反应液中添加试剂时要先加入RNasedH2O和5×PrimeScriptBuffer2(forRealTime)，混合后再添加RTPrimerMix、PrimeScriptRTEnzymeMixI，轻轻混*4使用RTPrimerMix可以高效合成cDNA。因为实验目的不同，也可以不使用RTPrimerMix，而选择OligodTPrimer或GeneSpecificPrimer进行反转录反应，引物使用量如下：OligodTPrimer50pmol／20μl反应GeneSpecificPrimer5pmol／20μl反应反转*6使用GeneSpecificPrimer时，建议反转录反应条件设置为42℃15min。PCR反应有非特异性扩增时，将温度升到50℃会有所改善。*7合成的cDNA请于-20RealTimePCR反应。以下是使用本制品进行反转录反应后，选择SYBR®PremixExTaqTMII（PerfectRealTime）（TaKaRaCode：DRR081）进行RealTimePCR反应的采用TaqMan®探针法进行检测时，请选择PremixExTaqTM（PerfectRealTime）（TaKaRaCode：DRR039）。应用ThermalCyclerDice®RealTimeSystem请按照ThermalCyclerDice®RealTimeSystem（TaKaRaCode：TP800）的使用说明书要求验操①按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行SYBR®PremixExTaqTM12.5PCRForwardPrimer（10μM）PCRReversePrimer（10μM）RT反应液（cDNA溶液）dH2O（灭菌蒸馏水1.01.028.50.40.4μM范围内调整引物浓度*2建议在25μl反应液中使用相当于10pg～100ngTotalRNA量的cDNA为模板。反转录反应液的加入量过PCR反应液总体积的10%。②进行RealTimePCR建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。退火/延伸时间可在20～30秒范围内进行调整，推荐使用30秒的条件。由于使用TmPCR试进行三步法PCR扩增反应。两步法PCRStage1：预变性95℃30Stage2：PCR95℃5 30-60秒Stage*使用SYBR®GreenI时进行aaaExaqSaotttDAtSa用NC9℃、15RR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。③实验结果分析反应结束后确认RealTimePCR的扩增曲线和融解曲线（使用SYBR®GreenI时），进行PCR定量时制作AppliedBiosystems书要求进行实验①按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行SYBR®PremixExTaqTMII（2×）PCRForwardPrimer（10μM）PCRReversePrimer（10μM）ROXReferenceDyeorDyeII（50×）*3RT反应液（cDNA溶液）dH2O（灭菌蒸馏水10250.820.40.820.40.41246162050*1常引物终浓度为0.4μM以得到较好结果。反应性能较差时0.2～1.0μM围内调整引*2建议在20μl反应液中使用相当于10pg～100ngTotalRNA量的cDNA为模板。反转录反应液的加入量过PCR反应液总体积的10%。*3ROXReferenceDyeII（50×）比ROXReferenceDye（50×）浓度低，使用7500Real-TimePCRSystem和7500FastReal-TimePCRSystem时，请使用ROXReferenceDyeII（50×）。与使用ROXReferenceDye（50×）相比，校正后的荧光信号值高，但解析结果完全相同。使用ABIPRISM7000/7700/7900HT及7300Real-TimePCRSystem时，请使用ROXReferenceDye（50*496孔板、Single-Tube、8联Tube采用50μl反应体系，384孔板、96-wellFastThermalCyclingte采用20μl反应体系。②进行RealTimePCR建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。两步法PCRStage1：预变性95℃30Stage2：PCR反应95℃560℃30～34秒*Dissociation*使用77007900HT时请设定在30秒。使用7000和7300时请设定在31秒。使用7500时请设定在34秒。本制品中使用的TaKaRaExTaqHS是利用抗Taq抗体的HotStart用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型HotStart用DNA聚合酶相比，不需要PCR95℃、5～15温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。③实验结果分析反应结束后确认RealTimePCR的扩增曲线和融解曲线（使用SYBR®GreenI时），进行PCR定量时制TotalRNA中混 组DNA的去除效果验使用提取的MouseLiverRNA2μg进行gDNAEraser添加（+）/不添加（-）实验后，再进行RTase不加的反转录反应，以确认TotalRNA中组DNA的残存量。每个反应做3个复孔RealTimePCR反试剂： SYBR®PremixExTaqTM（PerfectRealTime）（TaKaRaCode：DRR041）模板： 上述反转录反应液2μl 25Target Mouse 使用TaKaRaRealTimePCR用引物数据库中的引物反应条件 ThermalCyclerDice®RealTimeSystem标准反应条RealTimePCR扩增曲线图如下：从以上扩增曲线结果可以看出，TotalRNA经过gDNAEraser处理后，没有检测到组DNA的残留cDNA合成量比较试剂 DRR047A；PrimeScript®RTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealDRR037A；PrimeScript®RTreagentKit（PerfectRealTime）模板： MouseLiver来源TotalRNA2pg-2μg以及灭菌水反应体积 20RT RTPrimer 各Kit推荐的反应条RealTimePCR反试剂： SYBR®PremixExTaqTM（PerfectRealTime）（TaKaRaCode：DRR041）模板： 上述反转录反应液2μl 25Target Mouse 使用TaKaRaRealTimePCR用引物数据库中的引物反应条件 ThermalCyclerDice®RealTimeSystem标准反应条StandardY=－3.425×LOG（X）+Y=－3.429×LOG（X）+从以上实验结果可以看出，使用PrimeScript®RTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）进行反转录反应，与TaKaRa深受好评的现有制品DRR037同样，可获得高质量的RealTimePCR用cDNA。进行RealTi