诊断学教学课件：溶血性贫血的实验室检测

溶血性贫血的实验室检测溶血性贫血的定义指各种原因导致红细胞生存时间缩短、破坏增多或加速，而骨髓造血功能不能相应代偿而发生的一类贫血溶血性贫血的分类按溶血部位分为血管内溶血

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PNH☆

血型不合输血☆

输注低渗溶液溶血性贫血的分类按溶血部位分为血管外溶血☆

遗传性球形红细胞增多症☆

温抗体型自身免疫性溶血性贫血溶血性贫血的分类按病因和发病机制分为红细胞内在缺陷所致的溶血性贫血红细胞外因素所致的溶血性贫血（一）红细胞内在缺陷

1.遗传性：（1）膜的缺陷：遗传性球形细胞增多症（2）酶的缺乏：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏（3）珠蛋白生成障碍：即血红蛋白病①肽链合成量的异常：海洋性贫血②肽链质的异常：异常血红蛋白病2.获得性：阵发性睡眠性血红蛋白尿（二）红细胞外在因素

1.免疫性因素：（1）自身免疫性溶血性贫血（AIHA）（2）同种免疫性溶血性贫血：①新生儿溶血症；②血型不合的输血反应2.物理和机械损伤：（1）行军性血红蛋白尿症、人工心脏瓣膜（2）物理损伤：大面积烧伤、放射损害3.化学药物和生物因素：（1）磺胺类、苯类、砷和铅等（2）疟疾、溶血性链球菌、支原体肺炎、蛇毒和毒蕈中毒溶血性贫血的实验室检测溶血性贫血的筛查检测红细胞膜缺陷的检测红细胞酶缺陷的检测珠蛋白生成异常的检测自身免疫性溶血性贫血检测阵发性睡眠性血红蛋白尿症检测循环血液红细胞血红蛋白间接胆红素单核巨噬细胞系统尿胆原正常红细胞代谢与葡萄糖醛酸结合直接胆红素粪胆原尿胆原尿胆素门静脉循环血液红细胞血红蛋白间接胆红素单核巨噬细胞系统尿胆原溶血性黄疸的发病机制与葡萄糖醛酸结合直接胆红素粪胆原尿胆原尿胆素门静脉含铁血黄素尿血浆高铁血红素清蛋白血红蛋白↑血清结合珠蛋白↓溶血性贫血的筛查检测（一）血浆游离血红蛋白检测参考值＜50mg/L（1～5mg/dl）临床意义血管内溶血时血浆游离血红蛋白明显增高溶血性贫血的筛查检测（二）血清结合珠蛋白检测参考值

0.7～1.5g/L（70～150mg/dl）临床意义各种溶血时血清结合珠蛋白均有减低，以血管内溶血减低为显著。肝脏疾病、先天性无结合珠蛋白血症等也可减低或消失溶血性贫血的筛查检测（三）血浆高铁血红素清蛋白检测正常结果阴性临床意义阳性表示为严重血管内溶血溶血性贫血的筛查检测（四）含铁血黄素尿试验（Rous试验）正常结果阴性临床意义慢性血管内溶血可呈现阳性，并持续数周。常见于阵发性睡眠性血红蛋白尿。溶血性贫血的筛查检测（五）红细胞寿命测定是确定溶血性贫血的可靠方法正常RBC半衰期：25-32天溶血时＜15天红细胞膜缺陷的检测（一）红细胞渗透脆性试验原理红细胞在低渗氯化钠溶液中逐渐膨胀、破裂而溶血。测定红细胞对不同浓度低渗氯化钠溶血的抵抗力，即红细胞渗透脆性

正常渗透脆性

低渗溶液中的异常溶血红细胞膜缺陷的检测（一）参考值

开始溶血：0.42％～0.46％（4.2～4.6g/L）NaCl溶液完全溶血：0.28％～0.34％（2.8～3.4g/L）NaCl溶液临床意义

脆性增高：遗传性球形红细胞增多症

脆性减低：海洋性贫血红细胞膜缺陷的检测（二）红细胞孵育渗透脆性试验原理

红细胞孵育过程中，葡萄糖消耗增加，贮备的ATP减少，红细胞膜钠泵主动转运受阻，钠离子在红细胞内聚集，细胞膨胀，渗透脆性增加。参考值

未孵育：50%溶血为4.00～4.45g/LNaCl溶液37℃孵育24h：50%溶血为4.65～5.90g/LNaCl溶液临床意义

用于轻型遗传性球形细胞增多症、遗传性非球形细胞溶血性贫血的诊断和鉴别诊断红细胞膜缺陷的检测（三）自身溶血试验及纠正试验原理

先天性非球形细胞性溶贫，由于红细胞内酶缺陷，葡萄糖酵解障碍，不能提供足量ATP,以维持红细胞内的钠泵作用。自身血浆中温育48h，ATP贮备减少，钠泵作用减弱，导致溶血增强。在孵育过程中，分别加入葡萄糖和ATP作为纠正物，并以氯化钠为对照，观察溶血是否能纠正。方法参考值正常人红细胞经孵育48h后，仅轻微溶血、溶血度＜3.5％；加葡萄糖和加ATP孵育，溶血明显纠正，溶血度＜1％临床意义可用作遗传性球形细胞增多症和先天性非球形细胞性溶血性贫血的鉴别诊断遗传性球形细胞增多症：经孵育后溶血明显增强，常为正常的5-10倍，加入葡萄糖和ATP后溶血明显纠正。先天性非球形细胞增多症Ⅰ型：G6PD活性下降，加入葡萄糖和ATP后溶血部分纠正。Ⅱ型：丙酮酸激酶缺乏，加葡萄糖不能纠正，能被ATP纠正。PNH,AIHA和药物性溶血等加入葡萄糖后效果不一，加ATP可明显纠正。

红细胞酶缺陷的检测（一）高铁血红蛋白还原试验原理

在足量的NADPH存在下，高铁血红蛋白能被还原成亚铁血红蛋白。G6PD不足或缺乏时，高铁血红蛋白还原速度减慢，甚至不能被还原方法参考值高铁血红蛋白还原率＞75％高铁血红蛋白0.3～1.3g/L临床意义减低：G-6-PD缺陷

红细胞酶缺陷的检测（二）氰化物-抗坏血酸试验原理

抗坏血酸与氧合血红蛋白结合后生成H2O2，加入氰化钠可以抑制过氧化氢酶活性，阻止H2O2分解。H2O2氧化氧合血红蛋白生成高铁Hb，使血液呈棕色。

正常人通过谷胱甘肽还原酶和G6PD的作用产生NADPH,进而还原组氨酸为血红蛋白而呈红色。G6PD缺乏症因红细胞内G6PD和GSH减低，故测定液仍呈棕色。临床意义

纯合子G-6-PD缺乏的血液在2h内即变色，杂合子者3～4h变色。正常血液需更长时间才变色红细胞酶缺陷的检测（三）变性珠蛋白小体生成试验原理

G-6-PD缺乏可致红细胞内的还原型谷胱甘肽含量减少，随之出现高铁血红蛋白增高，最后形成变性珠蛋白小体（Heinzbodies）参考值＜30％临床意义

G-6-PD缺陷症，不稳定Hb、HbH病等常高于45％红细胞酶缺陷的检测（四）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验和活性测定参考值与临床意义正常人有甚强荧光G-6-PD缺陷者荧光很弱或无荧光杂合子或某些G-6-PD变异体者则可能有轻到中度荧光。正常人酶活性为（4.9±1.43）U/gHb红细胞酶缺陷的检测（五）丙酮酸激酶荧光筛选试验和活性测定参考值

正常丙酮酸激酶（PK）活性荧光在20min内消失

酶活性（15.1±4.99）U/gHb临床意义

PK严重缺乏（纯合子）荧光60min不消失；杂合子荧光25～60min不消失；珠蛋白生成异常的检测（一）血红蛋白电泳参考值正常人的电泳图谱显示4条区带，最靠阳极端的为量多的HbA，其后为量少的HbA2，再后为两条量更少的红细胞内非血红蛋白成分临床意义HbA2增高是诊断β-轻型地中海贫血的重要依据

珠蛋白生成异常的检测（二）胎儿血红蛋白酸洗脱试验

原理

HbF抗酸能力较HbA强。经固定后的血片，置酸性缓冲液中保温一段时间，只有含HbF的红细胞不被洗脱，如用伊红染色呈红色。临床意义

脐带血、新生儿、婴儿阳性，成人小于1％。地中海贫血患者轻型者（杂合子）仅少数红细胞呈阳性，重型者阳性红细胞明显增多珠蛋白生成异常的检测（三）胎儿血红蛋白测定或HbF碱变性试验原理在碱性溶液中，HbF不易变性沉淀，其他Hb在碱性溶液中可变性被沉淀，测定其溶液中Hb含量，即HbF含量。参考值成人＜2％，新生儿55％～85％，1岁左右同成人临床意义增高：β地中海贫血明显增高珠蛋白生成异常的检测（四）HbA2定量测定（hemoglobinA2）参考值：1.1％～3.2％限制性内切酶谱分析（restrictionendonucleasespectrumanalysis）

为Hb病的基因诊断自身免疫性溶血性贫血检测（一）直接Coomb实验阳性说明病人红细胞表面包被有不完全抗体间接Coomb实验阳性说明病人血清中存在不完全抗体参考值直接、间接抗人球蛋白均呈阴性反应临床意义

1.

阳性新生儿溶血病、自身免疫性溶血性贫血、SLE、类风湿关节炎、恶性淋巴瘤

2.AIHA大多属于温抗体型（即于37℃条件下作用最强，主要为IgG），但也有小部分属冷抗体型（主要为IgM），故必要时应用于4℃条件下进行试验

3.间接Coombs试验主要用于Rh或ABO妊娠免疫性新生儿溶血病母体血清中不完全抗体的检测自身免疫性溶血性贫血检测（二）冷凝集素试验（coldagglutinintest）原理冷凝集素是一种可逆性抗体，在低温时可与自身红细胞、“O”型红细胞或与患者同型红细胞发生凝集，当温度增高时，凝集块又消失。参考值效价＜1∶40，反应最适温度为4℃临床意义某些AIHA病人的冷凝集素效价很高，有的可达64000或更高自身免疫性溶血性贫血检测（三）冷热双相溶血试验原理

PCH患者的血清中有双相溶血素，在0～4℃时溶血素与红细胞结合，并吸附抗体，但不溶血；当升温至30～37℃则发生溶血。参考值阴性临床意义阳性见于PCH阵发性睡眠性血红蛋白尿症检测（一）酸化溶血试验（Ham试验）原理

PNH患者的红细胞对补体敏感性增高，在酸化的血清中易溶血。此法较敏感，假阳性较少参考值正常人为阴性临床意义阳性主要见于PNH，某些AIHA发作严重时也可阳性阵发性睡眠性血红蛋白尿症检测（二）蔗糖溶血试验原理蔗糖溶液离子浓度低，经孵育可加强补体与红细胞膜的结合，使PNH患者的红细胞膜上形成小孔，蔗糖水进入红细胞导致溶血。参考值

阴性临床意义

PNH常为阳性。

此试验可作为PNH的筛选试验阵发性睡眠性血红蛋白尿症检测（三）蛇毒因子溶血试验

蛇毒因子是以眼镜蛇毒中提取的一种分子量为144000蛋白质，它能直接激活血清中的补体C3，进攻PNH红细胞，造成溶血。本试验为特异性PNH试验阵发性睡眠性血红蛋白尿症检测（四）

血细胞表面锚连接蛋白缺失使血细胞抵抗补体进攻的能力降低，导致细胞容易破坏、溶血。可以通过检测锚连蛋白CD55、CD59的单克隆分子判断PNH。用荧光标记嗜水气单胞菌溶素前体的变异体FLAER,是诊断PNH更敏感、更特异的方法。

病例

患儿男，3岁3个月。因面色苍黄伴酱油色尿2d入院。查体：神志清醒，全身皮肤、面色苍黄，巩膜微黄，咽充血，双肺呼吸音粗，心音有力，律齐，心率125次／min，腹软，全腹散在轻压痛，肝右肋下3cm，脾左肋下可触及，四肢肌张力略低。

血常规化验：血红蛋白47g/L，白细胞44.6×109/L，血小板98x109/L，网织红细胞0.09。患儿籍贯安徽，病前12h曾经进食蚕豆100g。既往患儿曾有1次类似发作，但症状极其轻微，故家属未予重视。以酶动力学方法查G-6-PD酶活性为4.16IU/gHb、其父G-6-PD酶活性为6.07IU／gHb(正常值为5.83-14.45IU／gHb)，血常规提示存在重度贫血，急查尿常规蛋白(+)、红细胞(+++)，血气分析示严重代谢性酸中毒，住院12h患儿持续尿少，诊断为急性溶血性贫血、蚕豆病、肾损害。

给予输新鲜血、碱化尿液、调节酸碱平衡、激素治疗。住院44h患儿化验血尿素氮35.28mmol／L、肌酐601.12umol/L，并存在低钠血症、低钾血症。查体双肺密集细小水泡音，心率150次/min，肝脏右肋下10cm、脾脏左肋下3cm。存在急性左心衰、。肾功能障碍、溶血性贫血危象，给予多巴胺、地高辛治疗，并行腹膜透析。

住院49h患儿于腹透过程中突然出现面色青紫、呼吸心跳停止，立即给予心肺复苏，气管插管、复苏器加压给氧，转入PICU治疗，床旁胸片示急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，故予呼吸机通气，并继续进行腹膜透析，间断应用血浆补充蛋白，动态监测动脉血气、电解质、出入量、肾功能。

住院8d，患儿心力衰竭、肺水肿控制满意，尿量明显增多至790ml/d，血钾3.8mmol／L，血气正常，尿素氮27.76mmol／L、肌酐447.36斗mol／L，遂停止腹透。住院9