分子医学技能实验：实验六 蛋白质离子交换层析,蛋白质紫外

实验六·蛋白质技术1.离子交换层析浓缩蛋白质溶液2.紫外分光光度法测定蛋白质浓度1.离子交换层析浓缩蛋白质溶液基本概念

层析法是一种基于被分离物质理化和生物学特性的不同（吸附力、分子量、电荷性质、溶解度、亲和力），使其在某种介质中移动的速度不同而进行分离和分析的方法。————溶有叶绿素的乙醚碳酸钙粉末黄色的色带（叶黄素）绿色的色带（β-胡萝卜素）继续洗脱，分段收集，就可以使叶黄素和β-胡萝卜素分离一个经典的层析实验——叶绿素的层析分离色谱法层析的基本构成固定相——是层析的一个基质固体（吸附剂、凝胶、离子交换剂）

液体（固定在硅胶或纤维素上的溶液，如气液色谱、液液色谱等。）能与待分离物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用阻力：阻止所分离的样品向前移动流动相推动固定相上待分离的物质朝一个方向移动的液体、气体或超临界体等。

洗脱时所用的溶剂，也叫洗脱液。动力：不断地前移，并带动所分离的样品向前移动，如电压、吸附能力、气压等。分配系数（K）在一定条件下，某种组分在固定相和流动相中浓度的比值被分离物质本身的性质、固定相和流动相的性质、层析柱的温度洗脱用洗脱液冲洗层析柱，使样品中不同组分得以分离的过程。洗脱曲线以洗脱的体积为横坐标，组分的浓度为纵坐标作图所得的曲线下面积。(二)层析法分类1.根据分离原理：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析。2.根据流动相不同：液相层析（液-液层析，液-固层析）、气相层析（气-液层析，气-固层析）3.根据支持物方式：柱层析、纸层析、薄层层析、高效液相层析离子交换层析根据物质的带电性质不同而进行分离固定相：离子交换剂——人工交联的带有能解离基团的有机高分子，如离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶离子交换层析柱常用的阳离子交换纤维素（本身阴离子）有:

磺酸甲基纤维素(SMC)

羧甲基纤维素(CMC)

磷酸基纤维素(PC)常用的阴离子交换纤维素（本身阳离子）有:

二乙基胺乙基纤维素(DEAEC)

三乙基胺乙基纤维素(TEAEC)离子交换层析基本原理123451.平衡阶段:离子交换剂缓冲液中的相反电荷离子（平衡离子）结合2.吸附阶段：样品与平衡离子进行交换3、解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质4.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用平衡液中的

反离子样品溶液洗脱液

（梯度浓度）

蛋白质的等电点一般低于8，在pH为8的弱离子强度溶液带负电荷，可以被阴离子交换树脂吸附。当增加缓冲液离子强度或阴离子电负性时，可以将蛋白质成批量洗脱下来，达到蛋白质浓缩的目的。以用阳离子交换剂分离蛋白质为例，在一定的pH

条件下，等电点pI<

pH的蛋白带负电，不能与阳离子交换剂结合；等电点pI

>

pH的蛋白带正电，能与阳离子交换剂结合，一般pI

越大的蛋白与离子交换剂结合力越强。但由于生物样品的复杂性以及其它因素影响，一般生物大分子与离子交换剂的结合情况较难估计，往往要通过实验进行摸索。试剂:今天实验1：浓缩蛋白样品：低浓度蛋白质溶液阴离子交换树脂纤维素DE-52（DEAECelluloseDE-52

）

预溶胀微粒,为中等碱性阴离子交换剂

上样缓冲液低离子强度缓冲液：

0.02M磷酸缓冲液

-0.02MNaCl（

pH8.0）PI<8.0的蛋白可以被吸附？洗脱缓冲液低到高离子强度缓冲液：

0.02M磷酸缓冲液-----1MNaCl（pH8.0）实验操作及注意事项⑴预装层析柱（注意：不要干柱）⑵柱的平衡用1个柱体积的上样缓冲液过柱⑶浓缩前蛋白质浓度的测定取待浓缩的蛋白质溶液在752型分光光度计上测定蛋白质的OD280和OD260值⑷上样

加入低浓度蛋白质溶液（保护胶面,让样品全部进入树脂中。⑸平衡（洗杂质）用2个柱体积的上样缓冲液流过柱子。⑹洗脱

用1个柱体积洗脱缓冲液过柱，回收蛋白。（收集5-10管，每管3ml）⑺测定蛋白浓度在收集的过程中测定每管溶液的OD280和OD260读数，选取浓度最高管为浓缩蛋白——蛋白质含量的测定2.紫外分光光度法测定蛋白质浓度紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理原理：酪氨酸、色氨酸的苯环共轭双键，OD280最大吸收峰优点：简单、快速、样品可以回收缺点：有一定的误差（酪氨酸、色氨酸含量差异）受核酸类物质干扰注意：在紫外光下检测，使用石英杯实验操作与结果分析

在280nm和260nm两处波长分别测得光密度值、再按下列公式计算。1、OD280／OD260＜1.5时，用Lowry-Kalokar公式：

样本蛋白质含量(mg／m1)

＝1.5×OD280－0.75×OD2602、OD280／OD260﹥1.5时，用Lamber-Beer定律计算：

样本蛋白质含量(mg／m1)

=

OD280／