TSHRH 014-2018 化妆品 体外皮肤致敏试验-ARE-Nrf2 荧光素酶试验方法

ICS71.100.70C2682Y42T/SHRH014-2018化妆品体外皮肤敏试验-ARE-Nrf2 光素酶验方法CosmeticsInVitroSkinSensitisationAssay-ARE-Nrf2LuciferaseTestMethod2018-12-01发布 2018-12-30实施上海日用化学品行业协会发布PAGEPAGE12目 次前言 2范围 3规性用件 3术和义 3原理 45.测系…………………… 4仪与剂材 4试方法 5前 言本标准按照GB/T1.1-2009给出规则起草。本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。（本标准主要起草人：刘春凤、李小林、陈田、吴建铭、吕智、孙培文、林艺青、戴彦韵、万向红、李琼、高宏旗、金坚、陈亦华化妆品体外皮肤致敏试验-ARE-Nrf2荧光素酶试验方法范围本标准规定了体外皮肤致敏试验：ARE-Nrf2荧光素酶实验方法的术语、定义、实验方法。本标准适用于化妆品原料和成品皮肤致敏体外筛选试验。本标准可作为其他领域皮肤致敏体外测试的参考方法。SN/T2285 DSens转染了选择性质粒的HaCaT角质细胞ARE抗氧化反应元件。Keap1是一种能调节Nrf2活性的传感器蛋白。Nrf2参与抗氧化反应通路的转录因子。经受试物处理的细胞的荧光值与溶剂对照荧光值的比率。Imax与溶剂对照相比，荧光素酶活性的最大诱导倍数通过将标准差除以平均值来计算一组复制数据的变异性的度量。表达式的百分比可以乘以100。3.8 EC1.5荧光素酶基因诱导表达为1.5倍时的受试物浓度。IC30细胞活力降低30%的受试物浓度。IC50细胞活力降低50%的受试物浓度。原理DSensHaCaTKeap1-Nrf2-AREDSensARENrf2Nrf2Keap1-Nrf2-AREDSens细胞的构建方法：将融合了SV40启动子的ARE元件构建到含有荧光素酶的质粒上，将质粒转入HaCaT细胞，利用G-418筛选稳转细胞株，并通过PCR的方法确定基因的表达。DSensDSensHaCaTDMEMFBS115％C02、371％DMSO作为溶剂对照组本实验中，采用肉桂醛作为阳性对照，浓度分别为4，8，16，32，64μmol/L。测定空白的补偿光密度，孔里加入DPBS，不含细胞。0.9765625，1.953125，3.90625，7.8125，15.625，31.25，62.5，125，250，500，1000，2000μmol／L。仪器II6.1.2 3790%，5%CO2）6.1.3 （37℃）DSens离心机烘箱移液枪液氮罐排枪振荡器DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）（FBS）（5630min）0.25胰酶/EDTA（Trypsin/EDTA）青霉素（100U/mL）（100µg/mL））遗传霉素G-418（DMSO）20FBS、10DMSODMEM）（DPBS）CCK-8试剂（25、75cm2培养瓶、96）。1%BS的DEM10U1002010％DMSO的DMEM受试物暴露时所用的培养基：含1％胎牛血清DMEM培养基，无遗传霉素。受试物的制备：受试物溶于DMSO或者培养基中，浓度范围设置为：0.98-2000μmol／L（间隔系0.5）12DMSO1%5464o／（0.5MO,DSensDSens3790%±%，CO25.0%±IIDSensDSens细胞培养到80%-90%后需要进行传代，吸掉原培养液，DPBS清洗一次，加入0.25%胰酶（25cm20.5mL,75cm21进行消化5-10min2mLDMEM1：31：12DSens选择对数生长期细胞，用0.25%胰酶/EDTA溶液消化细胞，将细胞转移到15mL无菌离心管中，2005n（BS0DMO0%34106。1-703h1hDSens3775%7mL~10mLDMEMG-418)80%-90%个细胞37℃、5％C0224h(DMSO，CASNo.67-68-5)DMSODMSO(MW)40mg/mL4%(w/v)。如果使用DMSO2mmol/L。DMSO(12(0.098-200μmol/L)2540.982000μmol/L之间(2)。正DMSO120.196400g/ml之间)。2416962C1～C125μL，边缘的孔加入125μLDPBS。将孔板继续放培养箱培养48小时。48DPBS100μLDMEM10μLCCK-83h450nm（OD）值。注：CCK-8MTTMTTMTT48hDPBS96诱导倍数计算式中：

诱导倍数（I）=（L受试物-L空白）/（L溶剂-L空白）L受试物——受试物荧光读数；L空白——空白（不含细胞不含受试物）荧光读数；L溶剂——溶剂对照（阴性对照）荧光读数均值。EC1.5计算式中：

EC1.5（CbC）（1.5Ia（b）+CaCa——1.5μmol／L；Cb——1.5μmol／L；a——大于.5；——1.5。细胞活性计算细胞活性=（V受试物-V空白）/（V溶剂-V空白）*100式中：V受试物——受试物的吸收值；V空白——空白（不含细胞不加受试物）的吸收值；V溶剂——溶剂对照的吸收均值。ICx计算式中：

ICx=（Cb-Ca）*((100-x)-Va)/（Vb-Va）+CaX—— （%IC50Ca——x%μmol/L；Cb——x%μmol/L；axVb——x（。（4-64μmol/L）1.5EC1.5(7μmol/Lμmol/L之间64μmol/L2-820%。．受试物的最大诱导倍数ax大于等于1.esEC1.570%；EC1.51000μmol／L200μg/mL；iv<1000微克/毫升(或对未确定分子量的试验化学品为200微克/毫升)且在最高试验浓度时细胞活力<70%活力的受试物所获得的阴性结果也应视为非决定性结果。⑴受试物信息：单一成分名称，CAS编号；混合成分：尽可能的化学特性，组分成分及含量信息⑵物理外观、水溶性、DMSO溶解度、分子量以及其他相关理化性质；)⑷所使用的细胞系、其储存条件和来源(例如从其获得它们的设施)，测试用细胞的传代数和汇合度，试验前用于播种的细胞计数方法，以及为确保均匀的细胞数分布而采取的措施；⑸所使用的荧光素酶相关试剂及仪器，包括仪器设置、所使用的荧光素酶底物⑹结果EC1.5(IC50IC30)SD；绘制诱导荧光素酶活性和活力的剂量-反应曲线；其他相关意见的说明(如适用)。⑺结果讨论讨论DSens试验的结果；如果有其他相关信息，则应测试方法的结果综合讨论。实验室建立检测能力应完成表1中参考物质的测试，结果与其已知分类相符。1参考物质CASRN物理性状LLNA预测人体分类DSens 测EC1.5(μmol/L)参考范围IC50(μmol/L)参考范围Salicylicacid水杨酸69-72-7固体物Cat.6阴性>1000>1000Lacticacid乳酸50-21-5液体物Cat.6阴性>1000>1000Glycerol甘油56-81-5液体物Cat.6阴性>1000>1000Isopropanol67-63-0液体物Cat.5阴性>1000>1000Ethylene glycoldimethacrylate二甲基丙烯酸二醇酯97-90-5液体致敏物（）Cat.4阳性5-125>500Cinnamylalcohol肉桂醇104-54-1固体致敏物（）Cat.3阳性25-175>10002-Mercaptobenzothiazole2-巯基苯并噻唑149-30-4固体致敏物（）Cat.3阳性25-250>5004-Methylaminophenolsulfate4-甲氨基苯酚硫酸盐55-55-0固体致敏物（）Cat.3阳性<12.520-200Methyldibromoglutaronitrile甲基二溴戊二腈35691-65-7固体致敏物（）Cat.2阳性<2