分子生物学：生物分子的分离纯化

生物分子的分离纯化医学分子生物学∙第七章ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics生物大分子（蛋白质、核酸、糖复合物等）生物分子（Biomolecule）泛指生物体特有的各类分子，是自然存在于生物体中的分子的总称，是组成生命的基本单位。包括小分子（如脂类、激素、维生素等）ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics一、生物大分子的制备

生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics（1）分离纯化方法千差万别，没有一种标准方法可通用于各种生物大分子的分离制备；（2）制备几乎都是在溶液中进行的，难以准确估计和判断pH值、温度等各种参数对溶液中各种组份的综合影响

生物大分子的制备有以下主要特点：ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics（3）大多数生物大分子的含量极微，分离纯化的步骤多，流程长，有的目的产物甚至要经过几十步的操作才能达到所需纯度；（4）分离纯化过程中要保证目标产物的活性。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics生物大分子制备的一般步骤：确定制备的目的和要求文献调研和预备性实验建立相应的可靠的分析测定方法材料的破碎和预处理分离纯化方案的选择和探索产物纯度的鉴定产物的浓缩，干燥和保存。科研、开发或发现新的物质制备的关键要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰最困难的过程掌握目的产物的理化性质①特异性强②准确度高③灵敏度高④使用快捷方便ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics

制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间理化性质的差异。根据作用原理生物分子的分离、纯化可分为以下几种类型：（1）根据分子极性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、盐析法、分配层析法、分级沉淀法等；（2）根据分子形状和大小不同，如凝胶过滤层析等；（3）根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等；（4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、电泳、等电聚焦法等。（5）根据配体特异性，如亲和层析。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics破碎方法应用机械法研磨法细菌、酵母匀浆法机体软组织捣碎法动物韧性组织化学法酶解法细菌、酵母去垢剂组织、细胞有机溶剂细菌、酵母物理法反复冻融法细胞超声波法细胞悬液低渗裂解法红细胞冷热交替法细菌、病毒常用破碎方法ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics影响提取效果的因素（1）pH值（2）盐浓度（即离子强度）（3）温度（4）水解酶（5）搅拌与氧化（6）有机溶剂ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics

生物大分子的分离纯化（1）盐析法ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics（2）有机溶剂沉淀法ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics(3)透析(dialysis)

利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。含蛋白溶液透析袋透析液磁子电磁搅拌器ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics二、核酸的分离纯化

核酸（nucleicacid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础(包括DNA与RNA)。

无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。DNA与RNA理化性质及细胞定位上的差异决定了两者的最适分离与纯化条件的不同ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics分离纯化的原则

一是保持核酸碱基序列的完整性。二是尽量清除其它分子的污染，保证核酸制品的纯度。意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics对于核酸的纯化应达到以下三点要求：

1）核酸样品中不存在过高浓度的金属离子和对酶有抑制作用的有机溶剂；2）其它生物大分子如蛋白质、脂类和多糖分子的污染应降至最低程度；3）排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，提取RNA分子时应去除DNA。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics保持核酸的完整性

在整个操作过程中应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。1）温度不要过高(0～4℃)；(高温破坏氢键)2）控制pH值范围(pH值4-10);(极端酸碱破坏磷酸二酯键)3）保持一定离子强度;4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics核酸制备的技术路线ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics核酸的浓缩、沉淀与洗涤随着提取试剂的逐步加入，去除杂质时的丢失，样品中核酸的浓度会逐步下降，当不能满足后续研究与诊断所需时应对样品进行浓缩。沉淀是浓缩核酸的最常用且高效的方法，优点：①改变核酸的溶解缓冲液；②重新调整核酸的浓度；③去除溶液中某些盐离子与杂质。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics核酸的鉴定与保存（一）核酸的鉴定1.浓度鉴定核酸浓度的测定可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。⑴紫外分光光度法：该法是基于核酸分子中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm，这一物理特性。前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25μg/mlZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics⑵荧光光度法：核酸在荧光染料溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光，且荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics⒉纯度鉴定紫外分光光度法或荧光光度法皆可用于核酸制品的纯度鉴定。⑴紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8，纯RNA的比值为2.0。比值升高与降低均提示不纯。⑵荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较RNA大得多，电泳迁移率低。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics⒊完整性鉴定⑴琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果为依据。基因组DNA片段如发生降解，电泳图呈拖尾状。完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带的荧光强度积分应呈特定的比值，如有改变则提示有RNA的降解。此外，若在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA的污染。⑵其它方法：必要时，还可通过一些特殊的实验来鉴定RNA的完整性。如小规模的cDNA第一条链的合成反应，已知大小的某种mRNA的Northern杂交等ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics(1)对DNA①DNA样品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；在-70℃可保存数年②长期保存样品中可加入1滴氯仿。(2)对RNA

①RNA样品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70℃保存;②长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;③在RNA溶液中，加1滴0.2mol/LVRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。（二）核酸的保存ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics尽管基因组DNA因来源、性质以及制备的目的不同，其分离纯化的方法不尽相同，但有关分离纯化的原则、主要步骤、主要技术、主要试剂及其作用原理是一样的。基因组DNA分离纯化的一般程序见图7-4。真核基因组DNA的分离纯化ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics真核基因组DNA分离纯化的一般技术路线ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics1、酚抽提法本法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通过改良，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。

ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics裂解液中：EDTA：离子螯合剂，抑制DNase活性，降低细胞膜稳定性SDS：溶解细胞膜、核膜，乳化脂质、蛋白，并使其变性沉淀，同时变性DNase无DNase的RNase可高效水解RNA而避免DNA的消化蛋白酶K：消化DNase和细胞中的蛋白质酚：变性沉淀蛋白，抑制DNase活性pH8.0的Tris溶液保证抽提时DNA进入水相，防止DNA变性ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2、甲酰胺解聚法该法操作步骤少，但耗时，所得DNA浓度低，适用于制备大片段DNA1987年Kupiec等报道了甲酰胺（formamide）解聚法，该法的细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提法相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物（即染色质），然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶K和有机溶剂。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics3、玻棒缠绕法用该法收集高分子量DNA的沉淀始于20世纪30年代，现今使用的缠绕法是以1987年Bowtell的方法经改进而来。本法有两个关键步骤：一是基因组DNA沉淀在细胞裂解液和乙醇的交界面；二是将DNA沉淀缠绕在带钩玻棒上。带钩玻棒将大片段DNA从无水乙醇中转移至pH8.0的TE缓冲液中。该法以盐酸胍裂解细胞，制备的DNA片段约有80kb，适用于同时从不同细胞或组织标本中提取DNAZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics基因组DNA片段的纯化纯化的原则与要求纯化的方法有透析、层析、电泳及选择性沉淀等。无论采用何种方法从何种支持介质中纯化与回收所需要的DNA片段都要注意两个原则：一是提高片段的回收率；二要清除回收的DNA样品中的污染。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics回收率为提高DNA片段的回收率，可通过提高DNA样品的上样量和选择适宜的方法与材料而实现。2.纯度常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化的柱层析法（columnchromatography）。柱层析法采用的是阴离子交换层析的原理ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics从琼脂糖凝胶中回收DNA片段从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段的方法主要有二乙基氨基乙基（diethylaminoethyl，DEAE）-纤维素（cellulose）膜插片电泳法电泳洗脱法（透析袋及非透析袋电泳洗脱法）冷冻挤压法低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法等。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是压碎与浸泡法。它是将含待回收DNA条带的凝胶块切出，用吸头或接种针将其压碎，然后以洗脱缓冲液浸泡，使DNA洗脱出来。该方法能很好地回收小于1kb的ss或ds-DNA，依分子量不同，其回收率从小于30%至大于90%不等。回收的DNA纯度极高，无酶抑制剂，也无对转染细胞或微注射细胞有毒的污染物，虽费时但操作简单，是小片段DNA回收的较好方法。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics质粒DNA的提取与纯化ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics质粒DNA的提取与纯化的经典方法包括：

碱裂解法煮沸裂解法

SDS裂解法等这些方法主要由质粒DNA的扩增、质粒DNA的释放、质粒DNA的分离纯化三个步骤组成ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics1、碱裂解法在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下，用强阴离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。

ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics尽管碱溶液能破坏DNA中的碱基配对，但CCC质粒DNA因缠绕紧密而不易解链，只要不在碱性条件下变性太久，当pH调至中性时，CCC质粒DNA就可重新恢复天然的超螺旋。该法操作简单、重复性好且成本低，制备的质粒纯度能满足DNA测序与PCR等实验要求，是使用最广泛的方法ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2、SDS裂解法SDS裂解法是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，去壁细菌再用SDS裂解，从而温和地释放质粒DNA到等渗液中，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA

由于条件温和，该法特别适用于大质粒DNA（>15kb）的提取。但有一部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics3、煮沸裂解法该法条件剧烈，只能用于小质粒DNA的制备煮沸裂解法是将细菌悬浮于含TritonX-100和溶菌酶的缓冲液中，TritonX-100和溶菌酶破坏细胞壁后，沸水浴裂解细胞的同时可破坏DNA链的碱基配对，并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA变性，但CCC质粒DNA因结构紧密不会解链。当温度下降后，CCC质粒DNA可重新恢复其超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA，然后回收上清中的质粒DNA。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics质粒DNA的纯化1、CsCl-EB法利用CsCl形成的连续密度梯度，在过量EB存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。2、聚乙二醇沉淀法（一种分级沉淀法）3、柱层析法（树脂）ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsRNA极易被RNase水解，除胞内的RNase外，它还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中；RNase分子结构中二硫键的存在使其生物学活性非常稳定，加热煮沸及一般的变性剂均不能使其完全灭活，而且去除变性剂（denaturant）后，RNase的活性又可恢复。因此，在RNA的制备过程中，排除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键真核细胞RNA的分离纯化ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics

为获得完整的RNA分子，必须在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活胞内RNase的活性。选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）。蛋白酶K和能与蛋白质结合的阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠，并联合使用RNase的特异抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的降解。此外，在变性液中加入β-疏基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics由Chomczynski和Sacchi于1987年提出。它以含4mmol/L的(异)硫氰酸胍与0.1mmol/L的β-巯基乙醇的变性溶液裂解细胞，然后在pH4.0的酸性条件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤来制备RNA。本法具有简便、快速、经济、高效及提取的RNA质量高等优点，能在3小时内迅速处理多个标本。酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法分离总RNAZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsmRNA的分离纯化与序列明确的rRNA、tRNA、snRNA、scRNA不同，真核生物的mRNA在细胞中含量少，种类多且分子量大小不一。除血红蛋白及组蛋白的mRNA外，绝大多数mRNA在其3´末端带有长短不同的poly（A）尾巴。依据mRNA的结构特征，利用碱基配对原则，通过oligo（dT）-纤维素或poly（U）-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地从总RNA制品中分离纯化mRNA。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics1、oligo（dT）-纤维素柱层析法2、oligo（dT）-纤维素柱离心法3、oligo（dT）-纤维素液相结合离心法4、磁性球珠分离法

该法联合利用了oligo（dT）与poly（A）的互补配对、生物素（biotin）与链亲和素（streptavidin）的结合特异性以及磁性分离原理，可对poly（A）+RNA进行高效、灵敏及快捷的分离。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics5、其它方法Poly(U)-凝胶层析法:利用Poly(U)与Poly(A)的互补配对原理Poly(U)-滤纸法:将总RNA加到共价交联有Poly(U)的滤纸上,经洗涤后加热洗脱ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics三、蛋白质的分离与纯化ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics蛋白质的分离纯化是研究蛋白质化学组成、结构及生物学功能、新蛋白质的发现和疾病分子诊断的基础；分子克隆中，下游的处理和分析鉴定，基因工程产品的制备，也需要蛋白质的分离和纯化。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics蛋白质分离纯化的总目标是增加制品的纯度（purity）或比活（specificactivity），以增加单位蛋白质重量中靶蛋白的含量或生物学活性（比活常以活力单位数/毫克蛋白质表示），即从蛋白混合物中设法去除不要的杂蛋白和变性的靶蛋白，使靶蛋白的产量达到最高值。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics蛋白质分离纯化的一般技术路线ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics

分离纯化的总体原则

纯化蛋白质总是希望纯度和产率均高，例如纯化某种酶，理想的结果是比活力和总回收率均高，但实际工作中二者不能兼得，通常在科研上希望比活力尽可能高，而牺牲一些回收率，在工业生产和分子诊断中则正相反。一是保证靶蛋白结构的完整，防止降解和活性蛋白质的变性；二是尽量满足研究与诊断对靶蛋白纯度的要求。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics蛋白质分离纯化的条件蛋白质是一类结构复杂、有生物活性的生物大分子，离开天然的存在体系，其结构与活性变得极不稳定，因此从生物材料中提纯各种靶蛋白均需要特定的条件。应注意各种因素对靶蛋白的影响。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics缓冲液

盐、金属离子和螯合剂.3.还原剂4.去垢剂5.增溶剂

6.蛋白酶抑制剂（pronaseinhibitor）7.蛋白质的环境因素

①表面效应的影响②温度的影响③储存ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化是依据其溶解性、分子质量大小及形状、电离性质和生物学功能的差异而进行的。分离纯化的方法可分类如下：①以溶解度的差异为依据的方法：盐析、分配层析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀和结晶等；②以分子大小及形状差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤层析等；ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics③以电离性质差异为依据的方法：电泳、离子交换层析等；④以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics盐析法：将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。等电点沉淀法：净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质。有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（保持低温），破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics凝胶过滤层析(gelfiltration)凝胶色谱的机理是分子筛效应，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。

凝胶过滤层析亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics电泳蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)。电泳(elctrophoresis)ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics几种重要的蛋白质电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS）：常用于蛋白质分子量的测定。每一个蛋白质分子都因为结合了许多的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。由于所有的蛋白质颗粒都带有大量的负电荷，而且它们的电荷密度也大体相同，因此，Eq值接近一个常数。所以该法主要利用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白质。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics等电聚焦电泳（isoelectricfocusing，IEF）

通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。pH梯度以两性电解质ampholyte（脂肪族多胺和多羧同系物）在外电场作用下自然形成。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics

双向凝胶电泳two-dimensionalelectrophoresisZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics方法原理优点缺点凝胶层析分子筛的排阻效应分辨力高、不会引起变性凝胶介质昂贵、处理量有限离子交换层析各组份与离子交换剂亲和力不同分辨力高、处理量较大需酸碱处理树脂、操作耗时电泳法等电点、分子量、电荷的差异分辨力很高、可连续制备仪器试剂昂贵盐析法破坏水化膜和中和表面电荷操作简便、成本低、重复性好、对蛋白有保护作用分辨率差、纯化倍数低、沉淀中混杂盐分选择性沉淀等电点、热变性、酸碱变性等沉淀作用选择性较强、方法简便、种类较多应用范围较窄有机溶剂沉淀脱水作用和降低介电常数操作简便、分辨较强对蛋白质或酶有变性作用亲和层析蛋白质与配体之间特殊的亲和力分辨力很高局限性大高速与超速离心沉降系数或密度差异操作方便、容量大设备昂贵制备HPLC凝胶过滤、离子交换、反向色谱等分辩力很高、步骤少，仪器昂贵常用的蛋白质分离纯化方法ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质，蛋白质的分离纯化往往要采取多种方法联合使用，并通过预实验进行条