2023年大肠杆菌实验报告

大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选07400６3阿噟兰1.前言抗生素能破坏细菌细胞壁的结构,使细菌的繁殖和生长受到克制。但某些细菌对抗生素表现出抗性，因素是其基因发生了改变,产生能抵抗抗生素的性状。在自然情况下,细菌的基因突变率很低,并且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增长。如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时,可以促进遗传物质突变。ＤNA对紫外线（UＶ)有强烈的吸取作用,特别是碱基中的嘧啶,它比嘌呤更为敏感。紫外线引起ＤNＡ结构变化的形式有DNA链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。因此,紫外线通常作为诱变剂,用于微生物菌种选育。一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高,诱变最有效的波长25３~2６5nm。选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键,过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充足而减少诱变效果。在紫外线诱变下,菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。本实验想要得到的是可以抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。若菌株没有发生定向突变,则该菌株不能在抗性培养基上正常生长,只有发生了定向突变才也许在筛选培养基上正常生长。紫外线对于菌株有诱变作用外,对菌株尚有较强的致死作用,由于紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。因此,通过本实验的操作,在合适的照射剂量的设立下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上,能了解诱变育种的机理和方法,为做进一步的诱变实验做准备。2.材料和方法2.1实验材料、仪器和试剂菌种：大肠杆菌仪器:超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（5０mg/ｍl）、生理盐水２．2实验方法2.2.1制备培养基普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基（400ml):牛肉膏5g蛋白胨１0gNacl5g琼脂20g蒸馏水１0００mlPh７.0按配方配制好培养基后置于灭菌锅中１15℃1５min，倒平板,４皿*１5ml*5组+２皿*15ml=22皿*1５ml=33０ml筛选培养基（２00ml)：含抗生素5０mg/L。（卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，能结合细菌核糖体的３０Ｓ亚基上的16SｒRNA，阻断细菌蛋白质的合成。)牛肉膏5g蛋白胨10gNacｌ5g琼脂２0g蒸馏水1000ｍlPh７.０硫酸卡那霉素水溶液（50mｇ/ｍl）０．2mｌ,按配方先不要加硫酸卡那霉素配制然后115℃1５ｍin灭菌，取出培养基后冷却至６0℃时将硫酸卡那霉素0.２ｍl加入培养基中,充足震荡混匀，倒平板,２皿＊15ml*5组+2皿*１5ｍl=1２皿＊15ｍｌ＝1８0ml2.2．2制备菌悬液（106～108个/ｍL）①固体培养：大肠杆菌划线或涂布接种于固体培养基,37℃培养24-48h。②菌悬液:用适量生理盐水刮洗菌落，倒入一个无菌小三角瓶(或试管）中,充足振荡使菌体散开，得到菌悬液。③菌悬液浓度用血球计数板计数使用细菌计数板或血球计数板在显微镜下直接计数。将菌液滴在血球计数板0．１ml的计数格中，细菌被固定染色后,在显微镜下选择数出若干个小格中的细菌数目，(一般数１25个小格)，根据比例关系折算出单位体积菌液中细菌的数量。血球计数板规格:计数格=4*4=16大格1大格=5＊５=25小格小格体积=0.05*0.05*0.1＝0.0０025mｍ3=2.5*10-7ｍl(长*宽*高)计算方法例如:12５格中90个细菌,则（9０÷１2５）÷（2.5*10-７)个／ml=2.8８＊10６所以，125格中的细菌大约在3１(4格1个菌)—３125（每个小格25个菌）个。2．2.3诱变解决及接种将紫外灯打开，预热30ｍin；取无菌培养皿(Φ90mm,含无菌大针)，加入稀释好的菌悬液8ｍl以覆盖培养皿底面为宜。将待解决的培养皿置于诱变箱内的磁力搅拌仪上,启动磁力搅拌仪旋纽进行搅拌1分钟,然后打开皿盖,分别解决1０ｓ、２０ｓ、40s、80ｓ、160ｓ（可以累积照射),照射完毕后先盖上皿盖，再关闭搅拌和紫外灯；每个照射剂量分别取０.5ml分别稀释1００0倍和1０0倍，然后取稀释液0.１ml做普通培养基的涂布培养，每个解决两个反复；同时每个照射剂量取0．1mｌ照射液直接做两个筛选培养基的涂布培养。对照涂布培养:将照射的菌液稀释1000倍,在稀释液中取0．1ml做2个普通培养基涂布培养,２个筛选培养基的涂布培养。涂布要均匀,培养基表面无液流。3７℃培养２4h2.２.４.结果计数、分析、记录及讨论①以辐射时间为横坐标，以存活菌落数的lg值为纵坐标,作紫外线对大肠杆菌致死效应曲线。②列公式计算不同辐射剂量下的致死率。③计算并比较不同辐射剂量下大肠管杆菌的抗药突变率，并分析不同辐射剂量的诱变效果差异因素突变率=筛选平板菌数/普通平板菌数＊100%④抗药性菌株的筛选与纯化将一抗性克隆划线到一新的抗性平板上，与对照菌相比较,观测生长状况３．结果与分析3.1实验结果记录及初步整理表１.大肠杆菌诱变初始数据照射时间筛选培养基活菌数个／皿普通培养下稀释度普通培养基中菌数个/皿溶液浓度个/ml1号2号平均1号2号平均00００10050００５6005300５.3*107１000０10－22023１８201８２0１.8*10600０１0-３36625125１２.５*1０6200001０-22５6４４4.54.5*10４０0010-32０11＊１０4４000０1０－２2５33.5*103000１0-300008０00010－2502.52.5*10３０00１0－3４00202＊10516０000１０-2000０0０0１０－3000０３.2最佳照射时间的设立结合数据解决结果的图和表分析,在10ｓ的照射下,细菌死亡率达成了95%，２0ｓ时达成了99.9%，说明在20s内大部分菌株已经死亡，而整个实验过程中未发生任何正突变，也许与此有较大关系。已有实验证实，当菌种死亡率达成7０％~８0%时,突变率最大。所以在做进一步的实验中应当减少照射剂量，或通过增多10s内的照射设立，或增大照射距离，由于时间太短也许导致控制实验的难度加大。使死亡率变化曲线能突显出变化趋势。3.3筛选培养基选择筛选培养基是将发生突变的菌株从普通菌株中显现出来并对其浓缩。该实验中的筛选培养基中的添加剂是硫酸卡那霉素,若发生突变的菌株能对其显现出抗性,但这抗性也是有一定范围的,若超过其抗性范围即使发生突变也不能正常生长。本实验选用的５0mｇ/L,实验证明该浓度对于该菌种抗性选育来说已通过高,应当选择较低的浓度。可以在实验前对该菌种的最低致死浓度做检测。将制备好的出发菌株溶液涂布在含不同浓度硫酸卡那霉素的平板上,3７℃培养24h,观测不同平板上的菌落数,并记录不同抗生素作用浓度。凡是在前一个低浓度平板上已长出菌落而在后一个较高浓度平板上未长出菌落的,后一浓度即为某种抗生素对出发菌株的最低致死浓度【1】。表２．不同照射剂量下的存活率lg值和死亡率照射时间／s存活菌浓度存活菌的lg值死亡菌浓度致死率05.3*１077.72０01０2.5*1066.40５．05＊1070.９５３204.5＊１044.6５5.29*1０７0.９994０3.5*1０３３．545.299＊1070.9999802.５*1０３3．3９5．299*1070.９99916005.３*１０714.小结与讨论（1）本实验通过对大肠杆菌进行紫外线照射，欲得到抗性菌株，但由于照射剂量过大和抗生素浓度过高等因素未得到任何一株抗性菌株。(２）通过本实验,得到了在2８cm，下大肠杆菌的照射致死致死曲线，可以依此曲线反回归在该照射条件下选择合适的照射时间得到较高的突变率。（３)欲得到较高的抗性突变率,还可尝试改变培养温度,有实验证实不同的温度培养会对细菌的突变率导致影响【2】。(4)欲得到较好的突变率还需要较优质的菌株。由于菌株的突变重要是发生在遗传物质复制转录的过程中,所以菌株的生理活性对突变效率会有很大影响,最佳选择在对数期的菌株。状况比较同步、易变异、反复性较