方法选择与检测系统性能评价课件

第三章方法选择与检测系统性能评价教材第29页

方法学评价是通过实验途径来测定分析方法的性能指标，并评价其是否可接受。

方法学评价的目的在于评估该分析方法在稳定状态下具有的误差，并对这些误差做出判断，来决定该分析方法是否可以用于常规测定。

方法学评价内容，通常应包括：精密度、准确度、检测限、生物参考区间和可报告范围等。第一节

实验方法的选择

一、实验方法的分级

IFCC根据实验方法的准确度与精密度的不同可以分为三级:

决定性方法、参考方法、常规方法。特点

①准确度最高，相对误差最小，测量结果为“确定值”。②系统误差最小，经详细研究没有发现产生系统误差的原因。③常为绝对测量法（结果是绝对值）。在化学分析中，重量法和库仑法属绝对测量法，同位素稀释-质谱分析法（ID-MS）或中子活化法也可进行绝对测量法。④需精密仪器、高纯度试剂、训练有素的技术人员以及相应的环境。（二）参考方法（referencemethod）是指准确度与精密度已经充分证实的分析方法，干扰因素少，系统误差与重复测定的随机误差相比可以忽略不计，有适当的灵敏度、特异性、线性及较宽的分析范围。用于评价常规方法和试剂盒，为二级标准品、质控物定值。这类方法在条件许可的实验室（参考实验室）中使用。（三）常规方法（routinemethod）

性能指标符合临床或其他常规目的需要，有足够的精密度、准确度、特异性和适当的分析范围，简便经济实用。常规方法经充分评价，经学术组织认可，可以作为推荐方法。如IFCC推荐方法、卫生部临检中心推荐方法等。二、参考物的分级

参考物，也称标准品或标准物质，是一类具有一种或多种成分、含量均匀确定的物质。参考物用以校准仪器设备、评价测量方法或给其它物质赋值。参考物的结果含量一般表示为：标准值±总不确定度1.一级参考物（原级参考物）

是一种稳定而均一的物质，它的数值已由决定性方法确定，或由高度准确的若干方法确定，所含杂质也已经定量，且有证书。用于校正决定性方法，评价及校正参考方法以及为“二级参考物”定值。一级标准品的特点

（1）是已经确定的稳定而均一的物质。（2）所含杂质已被定性或定量地标明。（3）其数值由决定性方法确定，或由高度准确的若干方法确定。（4）有公认机构颁发的证书。

2.二级参考物（次级参考物）这类标准品可由实验室自已配制或为商品，它的值必须用一级标准品和参考方法并由训练有素的，能熟练掌握参考方法的操作者确定。主要用于常规方法的校准或为质控品定值和常规测定的结果计算。3.校准物（校准品）

用于常规分析仪器校准并具有可溯源性的标准物质。

常规测定用校准品：可以不是二级标准品。如一些知名公司提供的校准液或称定标液。但必须具有可溯源性。4.控制物（质控品）用于常规质量控制，用来控制患者标本的测定误差。质控物不能用于仪器的校准。决定性方法用途：评价参考方法及一级参考物一级参考物发展及评价参考方法，校准决定性方法及参考方法，为二级标准品定值参考方法为二级标准品及质控品定值，评价常规方法二级参考物、校准品常规方法的标准品，为质控品定值常规方法临床实验室的常规定量分析

质控品质量保证评价校准校准评价定值评价校准定值各级分析方法与参考物的互相关系测定结果测定控制测定1.适用性

（1）微量快速适用于急诊和成批分析。（2）方法简便无需特殊培训，试剂种类少，易于自动化分析。（3）安全可靠试剂无毒害，保存简便。（4）成本低廉试剂、仪器和辅助设备成本。（二）可靠性

具有较高的精密度、准确度和特异性，以及较大的检测范围。精密度：不精密度一般应小于3%。准确度：不准确度一般应小于5%。特异性：尽可能只对待测物特异。检测范围：能适合正常和大多数病理标本。

四、常规方法的选择步骤

临床提出要求广泛查阅文献确定候选方法进行评价实验…

进行EP9-A2的准备和步骤：1.熟悉检测系统，熟悉评价方案。2.对整个过程进行质量控制。3.至少应有40份患者新鲜标本，这些标本应涵盖线性范围，不要收集对实验有干扰的标本。4.按标本号1、2、3、4、5、6、7、8测定一次，然后8、7、6、5、4、3、2、1测定一次，不同检测系统同时进行。5.剔除离群值，绘制散点图，建立线性回归方程。6.判断是否可接受。六.定性试验的方法学评价（一）评价准备熟悉实验方法，选择合适的试剂，使用质量控制，使用阴阳性对照…（二）定性试验重复性评价

1.确定方法的临界值（cut-off），是判定阴性阳性的分界点。

2.准备临界值±20%浓度标本。

3.分别测定以上标本20次，记录阴性阳性结果。

4.测定结果阴性和阳性结果应该各占一半。

5.结论：测定结果阴性和阳性结果应分别大于95%了解（三）定性试验方法学比较样本种类和数量患者新鲜标本，稳定。阴性和阳性标本应分别在50例以上。2.实验过程在常规条件下，10-20天完成。3.以符合率进行结果描述。了解一、量值溯源的概念量值的溯源性

通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或标准的值能够与规定的参考标准，通常是与国家标准或国际标准联系起来的特性。二、参考物的量值溯源了解大小比例系统误差恒定系统误差比较方法结果试验方法结果系统误差类型示意图理想情况四、测量不确定度基本概念表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相联系的参数。（理解：测量不确定度是指由于测量误差的存在，而对被测量值不能肯定的程度，它表征被测量的真值所处的测量范围。）测量不确定度计算

A类不确定度估算=测量值标准偏差s×因子

B类不确定度估算=仪器误差总不确定度的合成：“平方和开平方”第三节检测系统性能评价评价的意义方法学评价，是通过实验途径测定分析方法的技术性能，并评价分析性能是否被临床所接受。评价的基本步骤

1.确定方法的质量目标，总允许误差

2.选定评价指标，重复、回收、干扰、比较…3.收集评价的实验数据，进行统计学分析

4.判断方法的临床可接收性什么是检测系统？完成一个项目检测涉及的仪器、试剂、校准品、测定方法、质量控制、保养计划等的（规定）组合。贝克曼LX20生化仪罗氏的检测试剂盒贝克曼的校准品葡萄糖氧化酶法如：葡萄糖测定贝克曼LX20生化仪贝克曼的检测试剂盒贝克曼的校准品葡萄糖氧化酶法两个不同的检测系统一、检测系统的概念及分类完整的检测系统自建的检测系统进行性能核实进行详尽的评估二、检测系统的评估方法一个检测系统从厂家的实验室搬运到我们的常规实验室，诸如环境（供电、供水、温度、湿度等）和操作人员等的改变，其性能是否还能保持和说明书上的描述一致？……因此需要评估（一）评估内容与检测结果质量相关的：精密度、准确度、可报告范围等。（二）评估方法重点是检测系统性能评价（方法学评价）

性能评价参考文件美国临床和实验室标准研究院（CLSI）公布一系列与方法学评价相关的文件，如：

EP5-A 精密度评价

EP6-A 线性评价

EP7-A 干扰实验

EP9-A2 方法比对。。。。。。必要时可以利用上述EP文件对我们的检测系统进行标准化的评估。三、精密度评价–

重复性试验

精密度是指同一样本在规定条件下多次重复测得的一系列单次值之间的接近程度，是表示测定结果中随机误差大小的指标。精密度一般以变异系数CV%表示重复性试验是评价精密度的常用方法。2.基本方法

对同一材料分成数份试验样品，进行多次分析测定，一般为20次。批内重复性：20次测定，计算x、s、cv%。批间重复性：一天内分数批重复20次测定，计算x、s、cv%。一般分5批每批作4次测定。cv%比批内大。日间重复性：每天1次，重复20天，计算x、s、cv。其cv反映实际工作情况。cv比批间大。－－－3.试验要点（1）

分析样品性质和分析物浓度分析样品：校准品、质控血清、病人标本都可分析物浓度：一般二个浓度参考值或在医学决定水平附近（2）

试验条件尽量在相同条件下进行性能可接受判断（1）批内或日内标准差应小于等于CLIA88规定的总允许误差的1/4（2）日间的标准差应小于等于CLIA88规定的总允许误差的1/3医学决定水平，就是临床上按照不同病情给予不同处理的指标阈值。EP5-A精密度评价方案介绍1.实验标本每天测定2次（2次测定间隔不得少于2小时），每次测定均作双份，共测定20天，收集80个数据（见表3-5）。2.统计处理

每双份的差值（批内差）反映了批内精密度每天2次均值的差值反映了天内的精密度

20天有20个批间差，减去批内差，反映了批间精密度

…（见p46）四、准确度的评价（一）准确度评价指标有：方法比较试验、回收试验和干扰试验。（二）方法比较试验实验方案：EP9-A21.基本方法：用两种方法同时对一组新鲜标本进行测定，根据测定结果的差异，得到恒定或比例系统误差。

2.实验要点：（1）比较方法的选择：尽可能选择性能高的方法，如参考方法。（2）实验标本与测定（见定量检测的方法学比对）标本例数、浓度分布、测定时间、测定顺序…比例系统误差恒定系统误差比较方法结果试验方法结果3.结果分析理想情况4.临床可接受判断：SE<½TEa为可接受水平。（三）回收试验

概念在常规分析样品中加入纯分析物，测定值是否与理论值相同的试验。目的是测定比例系统误差，以衡量候选方法的准确度。1.

基本步骤

将被分析的纯品标准液加入样品中，成为分析样品。原样品加入同量的无分析物的溶液作基础样品。然后用实验方法分析，两者测定结果的差值为回收量。32.回收率计算

加入浓度=标准液浓度回收浓度=分析样品测得浓度–基础样品测得浓度回收率（%）=一般要求回收率95-105%比例系统误差

=100%-平均回收率%3回收率接近100％分析不受基质影响。无论在纯溶液还是复杂的基质环境中，分析方法的反应能力是一样的。（准确度不受影响）回收率明显偏离100％分析明显受不同的基质影响。在不同的基质环境下，分析方法的反应能力有明显差异。（准确度受影响）回收率的理解：基质：分析样品中，除了被测物质之外的，都称为~3.

试验要点（1）加入标准液的体积在整个样品中要少于等于10%。（2）要准确吸量。一般每样品重复测定2-3次取均值。（3）分析样品浓度必须在测定方法的分析范围内。一般需做高中低三个浓度的回收试验，计算平均回收率。（4）分析样品浓度最好在医学决定水平上。可接受判断

一般：SE+RE<TEa（四）干扰试验

1.概念

在加入一定浓度的干扰物的，形成恒定系统误差，并将其测定出来。目的也是用来衡量候选方法的准确度。但干扰物浓度不同，误差大小也不同。干扰作用可有物理作用、化学作用以及非特异反应等。

2.方法基本与回收试验一样，但是加入的是疑有干扰或非特异性反应的物质。4干扰物测定物3.可疑干扰物的浓度应达到病理标本的最高浓度值，在确证有影响后，还应确定使分析结果影响临床应用价值的最低干扰物质浓度值。4.被试验的物质：

可根据该方法的反应原理，提示出可能的干扰物，一般应考虑的是用高胆红素、溶血（血红蛋白）、脂浊、防腐剂、抗凝剂等进行试验。但干扰试验有一定的局限性，因为人们只能试验某些物质的影响，还有许多药物和食物成分可能有干扰。五、检测限评价可检测的最低分析物浓度为检测系统的分析灵敏度或称检测限。分析灵敏度：具有定性含义的检测低限

具有定量含义的生物检测限

功能灵敏度如果空白吸光度的波动服从正态分布规律，则95％空白吸光度：空白均值±2s空白待测样品吸光度只有超过空白均值＋2s空白才被认为样品中有分析物99.7％空白吸光度：空白均值±3s空白待测样品吸光度只有超过空白均值＋3s空白才被认为样品中有分析物(一)检测低限空白管的波动原因：试剂空白的稳定性，比色皿的一致性，比色计的稳定性，……如：某5μg/L分析物的吸光度落在检测低限＝5μg/L（定性）（低于5μg/L时其吸光度与空白吸光度有重叠，无法分辨）对于患者标本的检测，稍大于检测低限的吸光度说明样品内有分析物，但是，这时还不能正确报告定量结果。因为是单次测定。对于这个接近检测低限的样品做多次重复测定，按照正态分布规律其响应值范围应该是X±2s或X±3s，即有50％测定结果会“无分析物”，有50％的测定结果“有分析物”。

那么多少检测吸光度时才能较好地报告定量结果呢？¯¯XB-2sBXBXB+2sB(检测低限）50％50％(二)生物检测限对于多个接近检测低限的样品做多次重复测定，按照正态分布规律其吸光度值范围应该是X±2s（或X±3s），这些较均值小的值就有可能和检测低限（空白吸光度值的上限）交叉。因此，这些样品检测吸光度的95％（或99.7％）单次检测吸光度的最低值也应该比检测低限大，从而保证样品在任何情况下，单次检测吸光度都不是空白吸光度，这些样品具有的分析物浓度才可以定量的报告。空白均值XB+2sB

生物检测低限的定义：某样品单次检测可能具有的最小吸光度刚大于检测低限吸光度，该样品内含有的分析物浓度为生物检测限。（可以定量报告结果的限值）(三)功能灵敏度以日间重复测定的CV为20％时，对应的检测限样品具有的平均浓度作为检测系统可定量报告的最低浓度。需要多个检测限浓度的样品来做精密度试验，从中选择CV接近20％的对应浓度，作为可定量报告的最低浓度值。分析物浓度越低，精密度实验CV值越大。六、可报告范围

可报告范围指可以报告的所有结果的范围。

1.分析测量范围：没有进行任何预处理（稀释，浓缩等）的样本，由方法仪器直接测出的结果范围。（也称线性范围）

2.临床可报告范围：对临床诊断、治疗有意义的待测物浓度范围，可以通过稀释、浓缩等方法扩大分析测量范围。

与标准曲线制作方法相同。在专用的标准曲线纸上画出标准曲线，并进行统计处理得出回归方程y=a+bx和相关系数（r）。线性好差没有很客观的判断指标，r接近1为好，0.99以上？？一般认为，如果b在0.97-1.03范围，a接近0，则可以判断测定方法可报告范围在实验所涉及的范围。基本步骤（1）样品准备：评价标本的基质应与实际测定的标本相一致，理想的标本是病人的低值或高值标本。这往往不易收集到，亦可用病人的混合标本加入分析物作为高值标本，用正常人标本作为低值标本（必要时可作处理如分析物为酶可以加热，小分子化合物可以透析，脂类可用超离心或多价阴离子沉淀）。

浓度范围应以分析项目的线性要求为准。线性评价应有5个不同浓度，可选择低值和高值标本各一个，低值标本为1号，高值标本为5号，二者3:1混匀为2号，等份混匀为3号，1:3混匀为4号，2-4号标本的浓度按下式计算：C2=1/5C1*3+1/5C5*1

C3=1/5C1*2+1/5C5*2

C4=

1/5C1*1+1/5C5*3（2）测定方法

5个样品各测定3-4次，结果进行统计分析，检验有无稀