真核基因表达调控-3分子生物学

MicroRNA(miRNA)DiscoveryBiogenesisBiogenesisComplexloadingselectionComparewithsiRNAFunctionsmRNAdegradationRibosomedrop-offInitiationblockTechnicalapplicationArtificialmiRNA2020/12/181Discovery1993年,LeeRC等在线虫(C.elegans)中意外地发现了一种定时调控胚胎后期发育的miRNA-lin4,它是一种非编码RNA,长度为22nt。2000年,miRNA-let7的发现掀起了寻找miRNA的热潮。在线虫（C.elegans）当中,通过功能缺失突变体的筛选，找到了let-7/lin-41基因2020/12/182不同物种中的let-7基因具有序列保守性,且均可与lin-41基因的3’UTR区域互补在lin-41基因的3’UTR区域发现了let-7的互补区2020/12/183TranscriptionofmiRNAgenesbyRNAPolIITranscribedbypolIItopri-miRNA(primaryprecursor)Pri-miRNAcontainsthe7-methylguanosinecapandapoly(A)tailPolIIisphysicallyassociatedwithmiRNAgenepromotersmiRNAgenetranscriptionissensitiveto-amanitinPolIIdependenttranscriptionenablestemporalandspatialregulationofmiRNAproduction.Biogenesis2020/12/1842020/12/185DuandZamore,Development132,4645-4652.animalsplantsBiogenesis2020/12/186ComplexloadingselectionMalloryetal.,CurrentOpinioninPlantBiology(2008)5’terminaldependentmiRNAsorting2020/12/187microRNA的作用机理ReductionofmRNAstabilityPlantmiRNAsguidecleavageoftargetmRNAs(howeveronlyafewmiRNAtargetshavebeenexaminedattheproteinlevel)AnimalmiRNAsalsoreducestabilityoftargetmRNAsInhibitionofmRNAtranslationlin-4mediatedregulationoflin-14;let-7mediatedregulationoflin-41OtheranimalmiRNAscausereducedtargetproteinlevelswithoutaffectingtargetmRNAlevelsincellcultureAtleastthreeexamplesofplantmiRNAsaffectingtargetproteinbutnotmRNAlevels2020/12/1882020/12/189miRNA介导的翻译抑制机制2020/12/1810与小分子siRNA相比，miRNA在分子特性等方面是相似的，但也存在不少的差异。siRNA是双链RNA，3‘端有2个非配对碱基，通常为UU；miRNA是单链RNA。siRNAs是由dsDNA在Dicer酶切割下产生，而成熟miRNAs的产生要复杂一些。与siRNA所介导的基因沉默机制不同的是，miRNA是一种内源基因的调控机制，代表了生物自身的一套正常程序。miRNA对靶基因的调控并不依赖于其与靶基因序列的高度互补性，如果miRNA与靶基因mRNA存在完全或者近乎完全互补配对，则通过靶基因mRNA的断裂方式调控基因表达；反之，miRNA则是通过翻译抑制调控靶基因的表达，miRNAs的这种调控方式主要依赖于miRNA的5’端2-8寡核苷酸序列“seedregion”与靶基因mRNA的3’UTR互补得以实现。2020/12/18118.5.1蛋白质磷酸化对基因转录的调控

细胞是生命活动的基本单位。细胞通过DNA的复制和细胞分裂将本身所固有的遗传信息由亲代传至子代，实现增殖繁衍。它们还不断地“感知”环境变化，并对其作出特定的应答。细胞应答可以分为3个阶段：外界信息的“感知”，即由细胞膜到细胞核内的信息传递,染色质水平上的基因活性调控,特定基因的表达，即从DNA→RNA→蛋白质的遗传信息传递过程。8.5真核基因其他水平上的表达调控2020/12/1812

蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程是生物体内普遍存在的信息传导调节方式，几乎涉及所有的生理及病理过程，如糖代谢、光合作用、细胞的生长发育、神经递质的合成与释放甚至癌变等等。2020/12/1813真核细胞主要跨膜信号传导途径2020/12/1814细胞表面的三类受体示意图2020/12/1815受体分子活化细胞功能的途径主要有两条：受体本身或受体结合蛋白具有内源酪氨酸激酶活性，胞内信号通过酪氨酸激酶途径得到传递；配体与细胞表面受体结合，通过G蛋白介异的效应系统产生介质，活化丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸激酶，从而传递信号。到目前为止，已发现的蛋白激酶基因多达2000余个。根据底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基种类可分为三大类：1、丝氨酸/苏氨酸型，2、酪氨酸型，3、组氨酸型。根据是否有调节物参与蛋白激酶的活性可分为两大类：信使依赖型和非信使依赖型。2020/12/1816

细胞表面受体与配体分子的高亲和力特异性结合，能诱导受体蛋白构象变化，使胞外信号顺利通过质膜进入细胞内，或使受体发生寡聚化而被激活。2020/12/1817蛋白质磷酸化和GTP结合蛋白参与的信号转导过程2020/12/1818G蛋白（GTPbindingproteins）所有能与GTP结合的蛋白质都可以称为“G蛋白”，并不是都参与细胞信号传递。所有的GTP结合蛋白都具有水解GTP生成GDP的能力，即具有GTP酶的特性，所以把所有GTP结合蛋白都归属于“G蛋白超家族”（GTP-bindingproteinsuperfamily）。在研究信号传递时特指与细胞表面受体偶联的异三聚体G蛋白（heterotrimericGTPbindingprotein）。G蛋白的基本结构：100kD左右，由α、β、γ三种亚基组成，在天然电泳中β与γ仍紧密结合在一起。α亚基分子量在39-46kD之间，差别最大，被用作G蛋白的分类依据。其共同的特点是，具有一个GTP结合位点，本身具有GTP酶的活性，即可以把GTP水解成GDP和无机磷酸.2020/12/1819异质G蛋白介导的生理效应配体受体效应物生理效应肾上腺素β-肾上腺受体腺苷酸环化酶糖原水解血清紧张素血清紧张素受体腺苷酸环化酶行为敏感好学光视紫红质cGMP磷酸二酯酶视觉兴奋IgE抗原复合物肥大细胞Ig-受体磷脂酶C分泌f-Met肽趋化受体磷脂酶C趋化性乙酰胆碱毒蝇碱受体K+通道降低起搏活性配体受体效应物2020/12/1820不同的Gα激发不同的调节途径2020/12/18211.受cAMP水平调控的A激酶依赖于cAMP的蛋白激酶称为A激酶（PKA），它能把ATP分子上的末端磷酸基团加到某个特定蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上。被A激酶磷酸化的氨基酸N端上游往往存在两个或两个以上碱性氨基酸，特定氨基酸的磷酸化（X-Arg-Arg-X-Ser-X）改变了这一蛋白的酶活性。在不同的细胞中，A激酶的反应底物不一样，所以，cAMP能在不同靶细胞中诱发不同的反应。2020/12/1822A激酶2020/12/1823非活性状态的PKA全酶由4个亚基R2C2所组成，分子量约为150-170，调节亚基与cAMP相结合，引起构象变化并释放催化亚基，后者随即成为有催化活性的单体。2020/12/1824糖原代谢时，激素与其受体在肌肉细胞外表面相结合，诱发细胞质cAMP的合成并活化A激酶，后者再将活化磷酸基团传递给无活性的磷酸化酶激酶，活化糖原磷酸化酶，最终将糖原磷酸化，进入糖酵解过程并提供ATP。2020/12/18252.C激酶与PIP2、IP3和DAG该蛋白激酶活性是依赖于Ca2+的，故称C激酶（PKC）。IP3(肌醇-1,4,5-三磷酸)引起细胞质Ca2+浓度升高，导致C激酶从胞质转运到靠近原生质膜内侧处，并被DAG(二酰基甘油)和Ca2+的双重影响所激活。DAG提高了C激酶对于Ca2+的亲和力。C激酶是一个7.7×104的蛋白质，主要实施对丝氨酸、苏氨酸的磷酸化，具有一个催化结构域和一个调节结构域。与DAG结合以后还能解除调节区所造成的抑制作用，提高酶活性。2020/12/1826C激酶磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸二酰基甘油肌醇-1,4,5-三磷酸2020/12/1827激酶信号传递及基因表达示意图磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸二酰基甘油DAG肌醇-1,4,5-三磷酸2020/12/18283.CaM激酶及MAP激酶Ca2+的细胞学功能主要通过钙调蛋白激酶（CaM-kinase）来实现的，它们也是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，但仅应答于细胞内Ca2+水平。MAP激酶（mitogenactivatedproteinkinase，丝裂原活化蛋白激酶）活性受许多外源细胞生长、分化因子的诱导。MAP-激酶活性取决于该蛋白中仅有一个氨基酸之隔的酪氨酸、丝氨酸残基是否都被磷酸化。2020/12/1829能同时催化这两个氨基酸残基磷酸化的酶被称为MAP-激酶-激酶，它的反应底物是MAP激酶。MAP-激酶-激酶本身能被MAP-激酶-激酶-激酶所磷酸化激活，后者能同时被C激酶或酪氨酸激酶家族的Ras蛋白等激活，从而在信息传导中发挥功能。2020/12/18304.蛋白质磷酸化与细胞分裂调控细胞通过p53及p21蛋白控制CDK（cyclin-dependentproteinkinase,周期蛋白依赖的蛋白激酶）活性，调控细胞分裂的进程。P21蛋白过量时，大量周期蛋白（cyclin）E-CDK2复合物与P21蛋白相结合，使CDK2丧失磷酸化PRb蛋白（retinoblastomaprotein，视网膜母细胞瘤蛋白）的功能。没有被磷酸化的PRb蛋白与转录因子E2F相结合并使后者不能激活与DNA合成有关的酶，导致细胞不能由G1期进入S期，细胞分裂受阻。2020/12/1831如果细胞中P53基因活性降低，P21蛋白含量急剧下降，周期蛋白E-CDK2复合物就能有效地将PRb蛋白磷酸化。此时，PRb蛋白不能与E2F相结合，后者发挥转录调控因子的作用，激活许

多与DNA合成有关的基因表达，细胞从G1期进入S期，开始分裂。2020/12/1832CDK（周期蛋白依赖的蛋白激酶）活性受双重调控没有周期蛋白，CDK无活性。随着周期蛋白的合成和积累，逐步形成周期蛋白-CDK复合物。CDK上的酪氨酸位点被磷酸化，掩盖了其ATP结合位点，ATP不能有效地与之相结合，CDK仍然无活性。CDK蛋白T-环中的苏氨酸位点被磷酸化，并将其酪氨酸位点上的磷酸基团去掉，其才能发挥生物学活性。同时，CDK蛋白还能使细胞中的磷酸酯酶磷酸化，以加速脱去自身酪氨酸位点上的磷酸基团。有生物活性的周期蛋白-CDK复合物能将DBRP(destructionboxrecognizingprotein)磷酸化，激活泛素连接酶，把大量泛素加到周期蛋白上并使之迅速降解，CDK失活，新的周期开始。2020/12/18338.5.3激素对基因表达的影响激素（Hormone）是高度分化的内分泌细胞合成并直接分泌入血的化学信息物质，它通过调节各种组织细胞的代谢活动来影响人体的生理活动。它是由内分泌腺或内分泌细胞分泌的高效生物活性物质，在体内作为信使传递信息，对机体生理过程起调节作用。现在把凡是通过血液循环或组织液起传递信息作用的化学物质，都称为激素。激素的分泌均极微量，为毫微克（十亿分之一克）水平，但其调节作用均极明显。激素作用甚广，但不参加具体的代谢过程，只对特定的代谢和生理过程起调节作用，调节代谢及生理过程的进行速度和方向，从而使机体的活动更适应于内外环境的变化。激素的作用机制是通过与细胞膜上或细胞质中的专一性受体蛋白结合而将信息传入细胞，引起细胞内发生一系列相应的连锁变化，最后表达出激素的生理效应。2020/12/1834几种常见的疏水性小分子激素的结构式2020/12/18351激素对靶基因的影响许多类固醇激素（如雌激素、孕激素、醛固酮、糖皮质激素和雄激素）以及一般代谢性激素（如胰岛素）的调控作用都是通过起始基因转录而实现的。体内存在的许多糖皮质类激素应答基因都有一段大约20bp的顺式作用元件（激素应答元件，简称HRE），该序列具有类似增强子的作用，其活性受激素制约。靶细胞中含有大量激素受体蛋白，而非靶细胞中没有或很少有这类受体。激素元件序列糖皮质GRETGGTACANNNTGTTCG雌激素EREGGTCANNNTGTCC甲状腺素TRECAGGGACGTGACCGCA2020/12/1836固醇类激素的受体蛋白分子有相同的结构框架，包括保守性极高并位于分子中央的DNA结合区，位于C端的激素结合区和保守性较低的N端。研究表明，激素、受体与顺式元件的结合位点三者缺一不可，其中无论是受体蛋白与激素的结合，还是激素本身，都不是与DNA结合并激活转录所必需的。通常情况下，受体蛋白中激素结合结构域妨碍了DNA结合区及转录调控区发挥生理功能，只有与相应激素结合后才能打破这种障碍。2020/12/18372020/12/1838Glucocorticoidsregulategenetranscriptionbycausingtheirreceptortotransportintothenucleusandbindtoanenhancerwhoseactionisneededforpromoterfunction.2020/12/18392020/12/18402.激素的作用机制有3种较为流行的假说：受体流动假说。激素-受体复合物可在膜内移动并与腺苷酸环化酶结合，激活环化酶，引发后续效应。通过激素的稀释或解离，使受体和环化酶回复到非耦联状态。中介物假说。受体与酶之间可能通过膜脂耦联在一起。有人用适量的高纯磷脂酶A处理肝细胞膜后发现，此时氟离子仍可刺激膜上的腺苷酸环化酶活性，但对胰高血糖素的作用完全丧失。若加入膜脂则激素的作用恢复，说明去膜脂后激素的信息传递中断。邻位互调假说。根据GTP能影响激素与受体结合并进而影响腺苷酸环化酶活性的现象，认为该酶系统至少存在3个活性部位，即激素-受体结合部位、Mg2+-ATP作用中心和核苷酸调节部位。因为腺苷酸环化酶有几种不同的立体构象，激素与GTP协同作用可使这几种不同的构象之间发生互变。2020/12/18418.5.4热激蛋白诱导的基因表达能与某个（类）专一蛋白因子结合，从而控制基因特异表达的DNA上游序列称为应答元件。应答元件主要有：热激应答元件（HSE）糖皮质应答元件（GRE）金属应答元件（MRE）应答元件与细胞内专一的转录因子相互作用，协调相关基因的转录。调控因子应答元件DNA序列结合蛋白热激HSECNNGAANNTCCNNGHSF镉MRECGNCCCGGNCNC？佛波酯TRETGACTCAAP1血清SRECCATATTAGGSRF2020/12/1842许多生物在最适温度范围以上，能受热诱导合成一系列热休克蛋白（heatshockprotein）。受热后，果蝇细胞内Hsp70mRNA水平提高1000倍，就是因为热激因子（heatshockfactor，HSF）与hsp70基因TATA区上游60bp处的HSE相结合，诱发转录起始。2020/12/1843热激蛋白调控的基因表达机制2020/12/18442020/12/18452020/12/18468.5.5RNA的加工成熟各种基因的转录产物都是RNA，无论是rRNA、tRNA还是mRNA，初级转录的产物只有经过加工，才能成为有生物功能的活性分子。1.rRNA和tRNA的加工成熟rRNA加工有两个内容，一个是分子内的切割，另一个是化学修饰。真核生物的rRNA基因转录时先产生一个45S的前体rRNA，然后前体rRNA很快就会被加工降解，生成不同相对分子质量的成熟rRNA。rRNA的化学修饰主要是核糖甲基化。tRNA基因转录时也可能先生成前体tRNA，tRNA基因的初级转录产物在进入细胞质后，首先经过核苷的修饰，生成4.5S前体tRNA，再剪接成为成熟tRNA(4S)。2020/12/1847原核rRNA前体加工示意2020/12/18482mRNA的加工成熟编码蛋白质的基因转录产生mRNA。这类基因产物在转录后要进行一系列的加工变化，才能成为成熟的有生物功能的mRNA。这些加工主要包括在mRNA的5'末端加"帽子"，在其3'末端加上poly(A)，进行RNA的剪接以及核苷酸的甲基化修饰等。由于mRNA的这些结构与它作为蛋白质合成模板的功能有密切关系，所以是基因表达的重要调控环节。编码蛋白质的基因转录时首先生成前体pre-mRNA(或称核不均一RNA，hnRNA)，然后再加工剪接为成熟mRNA。2020/12/18493真核生物基因转录后加工的多样性真核生物的基因可以按其转录方式分为两大类：简单转录单位复杂转录单位。这两种转录方式虽然最终都产生蛋白质，但它们的转录后加工方式是不同的。2020/12/1850简单转录单位。这类基因只编码产生一个多肽，其原始转录产物有时需要加工，有时则不需要加工。有3种不同形式：第一种简单转录单位，如组蛋白基因，它们没有内含子，因此不存在转录后加工问题，其mRNA3’末端没有poly(A)，但有一个保守的回文序列作为转录终止信号。第二种简单转录单位包括腺病毒蛋白IX、α-干扰素和许多酵母蛋白质基因，它们没有内含子，所编码的mRNA不需要剪接，但需要加poly(A)。第三种简单转录单位包括α和β-珠蛋白基因及许多细胞蛋白基因，这些基因虽然都有内含子，需要进行转录后加工剪接，还要加poly(A)，但它们只产生一个有功能的mRNA，所以仍然是简单转录单位。2020/12/1851简单转录单位转录后加工有3种不同形式2020/12/1852复杂转录单位。含有复杂转录单位的主要是一些编码组织和发育特异性蛋白质的基因，它们除了含有数量不等的内含子以外，其原始转录产物能通过多种不同方式加工成两个或两个以上的mRNA。也有三种情况：利用多个5’端转录起始位点或剪接位点产生不同的蛋白质利用多个加poly(A)位点和不同的剪接方式产生不同的蛋白质。这类基因调控点不在5‘末端和内含子的不同剪接，而在于有两个或多个加poly(A)位点，因此可通过不同的剪接方式得到不同的蛋白质。虽无剪接，但有多个转录起始位点或加polyA位点的基因。2020/12/18532020/12/1854

前mRNA不同的剪接方式造成了不同组织中不同的降钙素样蛋白2020/12/1855mRNA有效性的调控真核生物能否长时间、及时地利用成熟的mRNA分子翻译出蛋白质以供生长、发育的需要，是与mRNA的稳定性以及屏蔽状态的解除密切相关的。原核生物mRNA的半衰期很短，平均大约3min。高等真核生物迅速生长的细胞中mRNA的半衰期平均约为3h。在高度分化的终端细胞中许多mRNA极其稳定，有的寿命长达几天或十几天，加上强启动子的转录，使一些终端细胞特有的蛋白质合成达到惊人的水平。例如，家蚕丝心蛋白基因具有很强的启动子，几天内即可转录出105个丝心蛋白mRNA，而它的寿命长达4天，每个mRNA分子能重复翻译出105个丝心蛋白，所以4天内可产生1010个丝心蛋白，说明mRNA寿命的延长是mRNA有效性的一个重要因素。2020/12/18568.5.6翻译水平的调控1.真核生物mRNA的“扫描模式”与蛋白质合成的起始AUG的前和后序列