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具有激活皮肤成纤维干细胞功能的中药单体计算机分子模拟筛选及功效研究中山大学中山医学院顾怀宇教授神经抗衰老实验室2015-10-00

报告内容虚拟筛选细胞实验动物实验阶段总结未来规划参考文献第一章

计算机虚拟筛选定义虚拟筛选（virtualscreening,VS)

即在进行生物活性筛选之前，在计算机上对化合物分子进行预筛选，以降低实际筛选化合物数目，同时提高先导化合物发现效率。一、背景介绍筛选的对象化合物数据库虚拟的实际存在的优势不消耗样品，降低筛选成本考虑化合物分子的药动学性质和毒性，增加筛选的内涵虚拟筛选技术的分类根据靶点的结构知识基于靶点结构的虚拟筛选分子对接基于配体相似性的虚拟筛选药效基团搜寻基于靶点结构的虚拟筛选——分子对接起源：受体-配体的锁和钥匙模型

配体受体复合物分子对接筛选常用的软件DOCK是应用比较广泛的对接软件之一，由Kuntz等设计开发。它能自动模拟配体在受体活性位点的作用情况，并记录下最佳的相互作用方式。而且该软件能对配体的三维数据库进行搜索，因此被广泛用于基于受体结构的对接筛选。AUTODOCK也是常用的分子对接软件包之一，由Scripps的Olson科研小组开发。它采用模拟退火和遗传算法寻找受体和配体最佳的结合位置，用半经验的结合自由能方法来评价两者之间的匹配情况。为了加快计算速度，AUTODOCK采用了格点对接的方法，格点上保存的是探针原子和受体之间的相互作用能，包括了范德华相互作用能、静电作用能和氢键相互作用能等。除此之外，还有一些常用的对接筛选程序，比如FlexX、GOLD、Affinity、Glide等，它们都各自开发出一套相应的对接筛选策略、打分函数，使得对接筛选的应用越来越广泛。EGFREGFR是一种广泛存在的糖蛋白EGFR能促进表皮组织内多种细胞的生长分裂EGFR的激活可促进细胞新生，抗衰老找到一种调控的药物胞外域跨膜域胞内域EGFR的变构EGFR的工作机制13

14

EGFR可以启动两条主要通路，这两条通路最终都产生能够直接作用于细胞核内染色质的转录因子，调控细胞周期从而控制细胞的增殖1、Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK通路：

ERK作用于其底物（转录调节因子），磷酸化下游的Elk-1,ATF,NF-κB,Ap-1,c-fos和c-Jun，调节基因表达和细胞周期，具有促进细胞增殖的作用。其下游的信号通路仍未被完全阐明。152、PI3K-PKB-Akt(PKB)通路：

PKB是原癌基因AKT的产物，此通路与细胞的增殖相关。具体通路也未被完全阐明。以上通路都可以调节细胞的增殖与再生，因此，适当激活EGFR时，便可促进干细胞的增殖。二、项目分子模拟技术详情EGFR的胞外结构域与EGF结合的复合体161、明确模拟对象：

待计算配体以及EGFR蛋白结构，所有EGFR蛋白结构来自于蛋白质数据库，主要为解析度为2.8Å的EGFR胞外域晶体结构，以及解析度为3.3Å的结合了EGF的变构后的EGFR胞外域晶体结构。17本实验构建EGFR分子模型：正视图（左）和俯视图（右）2、制定模拟方案：

首先，我们使用软件SYBYL1.1修饰获得的PDB文件，删除冗余分子以及无关基团，以获得纯净的蛋白质晶体结构。19

其次，我们使用软件Autodock4.0设置空间坐标，通过拉马克遗传算法（Lamarckiangeneticalgorithm），规定药物分子的结合位点，一般而言，我们选定的活性位点即是配体（此处即为EGF）的结合位点。此时初始设置完毕。

正式模拟计算阶段，我们使用Autodock中的AutoGrid模块，计算配体和受体之间的结合自由能。此时为初步筛选，已经可以获得一部分分子与EGFR的亲和信息。20再次，我们使用AMBER11模拟套件进行分子动力学的模拟和数据分析。我们在EGFR的模拟中采用的力场是AMBERff03，这一力场对蛋白质二级结构的α-螺旋和β-折叠的受力施力分配较为均衡，因此更适合于EGFR的模拟。我们采用的模拟环境是TIP3P水盒子，即水环境，由于人体中主要成分是水，因此我们认为水环境下进行的模拟更有说服力。21

之后，我们进行配体的调整。我们首先使用Gaussian03程序进行配体分子的几何结构最优化，从而获得最稳定的静电势能。并且使用AMBERGAFF程序规定配体的其余力场参数，最后使用AMBER11软件的antechamber套件设定配体缺失的力场参数。至此分子模拟准备完毕。23

最终，我们可以计算出EGFR和配体的结合自由能，从而可以对配体激活EGFR的能力作出一个计算机评价。

以上模拟计算使用了搭载了192AMDOpteron处理器组的超级计算机。24三、计算结果1、中草药库部分

通过分子模拟，我们暂时从34441种中草药单体库中筛选出了6个可以与EGFR结合形成良好构象，并且在结合自由能评分中获得较高分数的中草药单体。其主要来自于肉苁蓉、三七、光甘草定。经过比对2007年化妆品卫生规范，以下中草药单体均符合化妆品卫生要求。两次得分：-11.3；-11.2三七皂甙Rd人参皂苷Rg127C48H82O18计算机模拟结合自由能得分值名称分子式C42H72O14两次得分：-11.3；-10.8两次得分：-8.5；-8.3人参皂苷Rb1C54H92O23两次得分：-11.2；-10.9三七皂苷R1肉苁蓉甙A28C47H80O18计算机模拟结合自由能得分值名称分子式C36H48O20两次得分：-11.5；-10.7两次得分：-8.5、-8.3光甘草定C20H20O42、短肽库部分

经过对短肽库的筛选，我们从4392种短肽中筛选出四种符合条件的短肽。它们分别为：

Arg-Arg-Tyr(RRY，精氨酸-精氨酸-酪氨酸)；

Arg-Phe-Trp（RFW，精氨酸-苯丙氨酸-色氨酸）；

Trp-Arg-Tyr（WRY，色氨酸-精氨酸-酪氨酸）；

Arg-Trp-Tyr（RWY，精氨酸-色氨酸-酪氨酸）。29两次得分：-9.5；-9.7精氨酸-精氨酸-酪氨酸30计算机模拟结合自由能得分值名称分子式两次得分：-9.6；-9.5精氨酸-苯丙氨酸-色氨酸两次得分：-9.4；-9.5精氨酸-色氨酸-酪氨酸31计算机模拟结合自由能得分值名称分子式两次得分：-9.3；-9.6色氨酸-精氨酸-酪氨酸32部分EGFR-配体作用3D模型计算机模拟Arg-Arg-Tyr--EGFR作用。结果显示：两次模拟得分分别为-9.5、-9.7；结合自由能：−31.2kJ/mol计算机模拟Arg-Trp-Tyr--EGFR作用。结果显示：两次模拟得分分别为-9.3、-9.6；结合自由能：−32.6kJ/mol36计算机模拟光甘草定-EGFR作用。结果显示：两次模拟得分分别为-8.5、-8.3；结合自由能：-33.7146kJ/mol第二章

细胞实验392.1、CCK-8法细胞筛选CellCountingKit-8简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲臜染料(参考图1)。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。40短肽RRY实验结果用不同浓度RRY(0.001、0.01、0.1、1、10、100、500μM)处理HSF细胞，cck-8检测HSF细胞的增殖，干预第一天，各组细胞增殖效应无显著差异；干预第三天，与对照组比较，RRY0.1、1、10μM处理组细胞增殖均高于对照组，差异有统计学意义（p<0.05）。41短肽RWY实验结果用不同浓度RWY(0.001、0.01、0.1、1、10、100、500μM)处理HSF细胞，cck-8检测HSF细胞的增殖，干预第一天，各组细胞增殖效应无显著差异；干预第三天，与对照组比较，RWY0.1、1、10μM处理组细胞增殖均高于对照组，差异有统计学意义（p<0.05）。42短肽RFW实验结果用不同浓度RFW(0.001、0.01、0.1、1、10、100、500μM)处理HSF细胞，CCK-8法结果显示：干预第一天，0.001、0.1、1、10、100、500μM浓度RFW组细胞增殖均高于对照组，0.01μM组均低于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）。干预第三天，0.001、0.01、0.1、1、10、100μM组吸光度值高于对照组，差异无统计学意义（p>0.05），而500μM组吸光度值低于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）。同时，各干预组干预1，3天，各孔的吸光度值随着干预时间的延长而上升。43短肽WRY实验结果用不同浓度WRY(0.001、0.01、0.1、1、10、100、500μM)处理HSF细胞，CCK-8法结果显示：干预第一天，0.001、0.01、0.1、10、100μM浓度WRY组细胞增殖均高于对照组，1、500μM组均低于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）。干预第三天，0.001、0.01、0.1、1、10、100、500μM组吸光度值低于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）。44中草药单体光甘草定实验结果用不同浓度光甘草定(0.001、0.01、0.1、1、10、100、500μM)处理HSF细胞，CCK-8法结果显示：干预第一天，0.001、0.01、0.1、1、10、100、500μM浓度与对照组相比无差异无统计学意义（P>0.05）。干预第三天，0.1、1、10μM组细胞增殖均高于对照组，差异有统计学意义（p<0.05）。综上，短肽RRY、RWY和光甘草定都能引起HSF增殖。我们在后续EdU实验中将继续验证以上三种分子对细胞的增殖效果。462.2、EdU法检测细胞增殖

EdU（5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷）是种胸腺嘧啶核一种胸腺嘧啶核苷类似物。它也能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。EdU检测染料只有通常抗体大小的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。EdU检测原理示意图采用EdU法分别定量检测药物干预条件下诱导3d后皮肤成纤维细胞的增殖能力，如图所示。结果显示：短肽Arg-Arg-Tyr对细胞增殖的促进作用以1μM作用最为明显。采用EdU法分别定量检测药物干预条件下诱导3d后皮肤成纤维细胞的增殖能力，如图所示。结果显示：短肽Arg-Trp-Tyr对细胞增殖的促进作用以1μM作用最为明显。采用EdU法分别定量检测药物干预条件下诱导3d后皮肤成纤维细胞的增殖能力，如图所示。结果显示：中草药单体光甘草定对细胞增殖的促进作用以10μM作用最为明显。512.3、流式细胞测细胞周期细胞固定后用PI（Propidiumiodide碘化丙啶），染色，因为PI特异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，可测出细胞的DNA含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。Pi分子结构Pi与DNA分子结合DNA细胞周期分析细胞周期G2MG0G1s

200

400

600

8001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量细胞数量2N4N

G1期为DNA合成前期，是细胞为S期的DNA的合成做准备的阶段；S期即DNA合成期，一般处于增殖旺盛阶段的细胞在此期细胞比例较高，持续时间较长；G2期为细胞分裂前期；M期为细胞有丝分裂期。采用流式细胞法分别定量检测药物干预条件下诱导3d后皮肤成纤维细胞的增殖能力，如图所示。结果显示：短肽Arg-Arg-Tyr对细胞增殖的促进作用以1μM作用最为明显。采用流式细胞法分别定量检测药物干预条件下诱导3d后皮肤成纤维细胞的增殖能力，如图所示。结果显示：短肽Arg-Trp-Tyr对细胞增殖的促进作用以1μM作用最为明显。采用流式细胞法分别定量检测药物干预条件下诱导3d后皮肤成纤维细胞的增殖能力，如图所示。结果显示：中草药单体光甘草定对细胞增殖的促进作用以10μM作用最为明显。结论：本章实验通过cck-8细胞增殖实验筛选具有生物活性短肽RRY、RWY和光甘草定；EdU增殖结果与cck-8细胞增殖实验基本吻合；流式细胞实验结果显示短肽RRY、RWY和光甘草定通过激活S期，从而促进细胞增殖。第三章

动物实验实验方法皮肤表面肉眼观察组织形态学观察标本采集石蜡包埋切片制作皮肤组织HE染色皮肤组织PCNA免疫组织化学染色镜检观察各组小鼠背部皮肤一般形态观察各组小鼠背部皮肤组织形态学观察各组小鼠背部皮肤组织免疫组织化学染色结果图13短肽RRY组PCNA免疫组化染色图14短肽RWY组PCNA免疫组化染色图15光甘草定组PCNA免疫组化染色结论：本章实验通过综合运用肉眼观察、HE染色方法、免疫组织化学染色方法，从组织形态生物学方面的实验，较全面的验证了短肽RRY、RWY和光甘草定对SD鼠皮肤的影响。结果显示短肽RRY、RWY和光甘草定对正常SD鼠皮肤组织无毒副作用，对于皮肤安全可靠。且能增强皮肤组织PCNA的表达，具有一定的修复作用。66第四章阶段总结

产生知识产权项本项目截止此阶段，预计可申报国家专利申请3项；本项目实验结束后，预计可撰写科研论文3篇；建议目前即可开始知识产权申请事宜。67第五章未来规划

中草药的粗提物是包含功能性单体的初级纯化产物，因其生产成本较低等特性，适合工业化大规模生产。同时，工业化生产的中草药粗提物其理化性质较稳定，可为功能性单体物质提供稳态的微环境。因此，功能性分子单体复配中草药粗提物是未来产业化研发的发展趋势，是基于生物化学分子调控研究的基础上，有较高可行性的实践方案。短肽的合成、同位素标记、体内代谢追踪。68参考文献[1]Echinacosideimproveshematopoieticfunctionin5-FU-inducedmyelosuppressionmice,SaisaiWang,GangZheng,ShoushengTian,LijuanShen,YongcholPak,YongShen,JingQian,LifeSciences123(2015)86–92.[2]NF-kBplaysakeyroleinmicrocystin-RR-inducedHeLacellproliferationandapoptosisLiangChen,XinZhang,JunChen,XuezhenZhang,HuihuiFan,c,ShangchunLi,PingXie,Toxicon87(2014)120-130.[3]Down-regulationofFRαInhibitsProliferationandPromotesApoptosisofCervicalCancerCellsinVitro,Li-XiaBai,LingDing,Shi-WenJiang,Hui-JieKang,Chen-FeiGao,ChenChe