rochetbil和dbil项目介绍课件

RocheTBIL和DBILTBIL和DBIL检测方法学比较DennyDong;Dec07,2012主要内容

胆红素的代谢胆红素的分类和临床应用胆红素的检测方法罗氏胆红素试剂盒特点胆红素检测的标准化

胆红素是胆汁中的主要色素，呈橙黄色。胆红素具有：脂溶性，难溶于水。毒性作用抗氧化（抑制亚油酸和磷脂的氧化）胆色素代谢以胆红素代谢为中心。

肝脏在胆色素代谢中起着重要作用反映肝脏的分泌与排泄功能。胆红素测定的作用胆红素的生成部位：肝、脾及骨髓等网状内皮细胞中衰老红细胞血红蛋白珠蛋白血红素还原胆红素单核-吞噬细胞系统识别、吞噬（肝、脾、骨髓）NADPH+H+FeCO胆绿素NADPH+H+(250~300mg/天)胆红素在血液中的运输胆红素：脂溶性，难溶于水增高胆红素的水溶性，有利于运输限制胆红素通透细胞膜对组织造成毒性作用血液：白蛋白胆红素白蛋白—胆红素复合物（可逆结合）竞争结合剂：

如磺胺药，水杨酸，胆汁酸等胆红素在肝中的转变婴儿出生7周后，体内Y蛋白才会达成人水平1.摄取白蛋白—胆红素复合物血液肝脏白蛋白(不可逆结合）胆红素特异受体细胞膜胞浆胆红素载体蛋白胆红素—Y蛋白胆红素—Z蛋白内质网胆红素在肠道中的变化

结合胆红素胆红素胆素原（无色）

(中胆素原、粪胆素原、尿胆素原)

粪胆素尿胆素葡萄糖醛酸基胆素肠道细菌非结合胆红素胆红素在体内的代谢胆汁胆色素代谢总结胆红素的分类（1）未结合胆红素(Bu)：未与葡萄糖醛酸基结合，具亲脂性，须加入加速剂破坏分子内部的氢键后才能与重氮试剂反应，又称间接胆红素。占总胆红素的4/5。（2）结合胆红素(Bc)

：与葡萄糖醛酸基结合，具亲水性，与重氮试剂直接反应，又称直接胆红素(DBIL)。占总胆红素的1/5。非结合胆红素的结构（α,Bu）血红蛋白的降解产物在血液中和白蛋白以非共价键的方式结合在肝脏被清除折叠的结构，几乎不溶于水。不能直接参与重氮反应是新生儿生理性黄疸的最好指标结合胆红素(β和γ;Bc)在肝细胞内由非结合胆红素转化而来在肝脏的酶作用，生成了单葡萄糖醛酸酯胆红素和双葡萄糖醛酸酯胆红素造成胆红素分子内各基团间原有距离增大，难以再形成氢键，由此，使胆红素的亲水基团暴露在外，表现出水溶性，便于从胆管排入肠道。是胆道梗阻解除后最敏感的指标可直接参与重氮反应，表现为直接反应的胆红素。黄疸的种类(按血清胆红素的来源)：

溶血性黄疸又称肝前性黄疸。

胆红素的来源>肝脏的转化能力游离胆红素过多肝细胞性黄疸又称肝原性黄疸。肝脏转化能力降低游离和结合胆红素均升高阻塞性黄疸又称肝后性黄疸。结合胆红素排泄障碍

结合胆红素过多黄疸是指高胆红素血症引起皮肤、巩膜和粘膜等组织黄染的现象。黄疸的鉴别诊断胆红素检测的临床意义（1）黄疸及鉴别

DBi/TB比值<20%溶血性黄疸比值40%~60%肝细胞性黄疸

比值>60%阻塞性黄疸（2）肝细胞损害程度和预后的判断。（3）新生儿黄疸病情掌握。（4）再障等疾病，TB减少。胆红素的异常代谢黄疸

1、胆红素（橙黄色）+弹性蛋白组织黄染巩膜、皮肤、黏膜2、根据血浆胆红素浓度，黄疸程度：—隐性黄疸（1.0~2.0mg/dl）—显性黄疸（>2.0mg/dl）

来源增多、去路受阻血浆胆红素浓度升高高胆红素血症⑴溶血性黄疸（肝前性黄疸）溶血→血浆游离胆红素↑肝脏中结合胆红素↑→肠道中胆素原重吸收↑→尿胆素原↑→尿胆素↑但是，血浆结合胆红素不变，尿胆红素阴性

溶血→血浆游离胆红素↑肝脏中结合胆红素↑→肠道中胆素原重吸收↑→尿胆素原↑→尿胆素↑但是，血浆结合胆红素不变，尿胆红素阴性。结合胆红素⑵肝细胞性黄疸（肝原性黄疸）肝脏对胆红素的摄取、转化障碍→血浆游离胆红素↑肝内毛细胆管破裂，结合胆红素返流入血→血浆结合胆红素↑→尿胆红素阳性尿胆素原、尿胆素不确定⑶阻塞性黄疸（肝后性黄疸）胆管阻塞破裂→血浆结合胆红素↑→尿胆红素阳性肠道中胆素原生成、重吸收减少→尿胆素原、尿胆素↓游离胆红素不变；尿三胆1、胆管阻塞破裂→血浆结合胆红素↑→尿胆红素阳性2、肠道中胆素原生成、重吸收减少→尿胆素原、尿胆素↓3、重氮试剂间接、直接反应双阳性；游离胆红素不变反相HPLC(A436nm)分离法时间(min)α:Bu未结合胆红素β:mBc单葡萄糖醛酸结合胆红素δ:Bd与白蛋白共价结合的胆红素KuenzleCC,etal.:四种血清胆红素及三种胆汁胆红素的分离和定量检测。JLabClinMed1966;67:282LauffJJ,etal.:血清和胆汁胆红素反相HPLC分离法。

JChromatogr1981;226:391γ:dBc双葡萄糖醛酸结合胆红素胆红素的四种成分在血液循环中结合胆红素和白蛋白形成的。白蛋白缓慢地非酶作用置换了原葡萄糖醛酸酯。类似于糖化血红蛋白。在长期的高结合胆红素血症患者的血液内，才能被检测出来。在血液循环中的清除缓慢。半衰期2-3周。因为胆红素不存在氢键的影响，所以胆红素可以与重氮直接胆红素反应。Bδ不能通过肾小球．故不从尿排出。Bδ只存在于人血清而不存在于胆汁，说明它不从胆汁排出，即它的代谢调节不依赖肝胆的排泄功能δ胆红素Bδ的代谢及其在疾病时表现与其它三种组份有重要差别。正常人血清中没有Bδ。新生儿黄疸：以Bu为主黄疽。体质性肝功能不良性黄疸：(Gilbert‘s综合症,葡萄糖醛酸基转移酶(UGT)不足引起）Bδ占TBIL<20%。阻塞性黄疸、肝细胞黄疸：Bδ占TBIL>50%。认为Bδ源于Bc。它的形成与肝的结合，与肝功能的成熟有关。δ胆红素MeRCOOR2CH2CH2MeMeMeRNHCHONHCHNHNHOCH2COOR1CH2CH2mBc=R1

=glucuronicacidandR2

=H(monoglucuronide)dBc=R1

and

R2=glucuronicacid(diclucuronide)结合胆红素的结构MeRCOOHCH2CH2MeMeMeRNHCHONHCHNHNHOCH2COOHCH2CH2CHMe=

CH3R

=

CH2非结合胆红素的结构

MeRCOOCH2CH2MeMeMeRNHCHONHCHNHNHOCH2COOCH2CH2δ胆红素:R1或

R2=白蛋白

共价键结合白蛋白白蛋白δ胆红素结构主要内容

胆红素的代谢胆红素的分类和临床应用胆红素的检测方法罗氏胆红素试剂盒特点胆红素检测的标准化胆红素检测的常用方法分类1.重氮盐法－diazoreaction原理：橙黄色的胆红素与重氮盐反应生成有色的偶氮胆红素（偶氮胆红素在酸性PH值为红色，碱性PH值为蓝色）

一般在酸性环境下，主波长546nm，次波长800nm2.氧化法-oxidativemethods原理：橙黄色的胆红素被氧化成绿色的胆绿素 450nm主波长，546nm次波长3.直接分光光度法（DirectSpectrophotometry）原理：直接检测胆红素的颜色，波长460nm（血清指数）4.高压液相色谱（HPLC）5.经皮直接测量（transcutaneousmethods）胆红素常用生化检测方法重氮盐法－diazoreaction2，5-二氯苯重氮四氟硼酸盐法（DPD法）改良Malloy-Evelyn法Jendrassik-GrOf法改良JG法改良间氨基苯磺酸法强生干片法氧化法－oxidative（enzymatic&chemicalmethods）胆红素氧化酶法（BOD)化学氧化法oxidative,chemicalmethods钒酸盐氧化法VanadateMethods硝酸氧化法过硫酸盐氧化法综合氧化剂法复合有机氧化法重氮法检测胆红素重氮反应（Ehrlich1883）1916年vandenBerghandMuller根据胆红素是否直接与重氮试剂反应，将其分为直接胆红素和间接胆红素，并且应用于临床。JendrassikandGrof法（1938年）结合胆红素反应快速。游离胆红素几乎不参与反应（分子折叠，不溶性）。当某些物质（强酸酸，乙醇，咖啡因和苯甲酸钠等

）的存在时，才会打开游离胆红素间的氢键，使溶解在水，并和重氮试剂反应。由Doumas领导的AACC小组对J-G方法改良(1983)。目前确定该方法为总胆红素的推荐法。总胆红素=具有加速剂的重氮反应直接胆红素=不加加速剂的重氮反应间接胆红素=总胆红素-直接胆红素。按照反应条件区分为直接和间接胆红素。重氮法检测总胆红素在使用加速剂的条件下，检测样品中的总胆红素（a、b、g、d胆红素总和）。目前，国际上确定了游离胆红素的标准，也明确采用J-G法检测血清总胆红素的方法为国际推荐方法。总胆红素的检测结果从1980年代后期起，实现了可比性。国内大多试剂厂商已采用胆红素血清为校准品。总胆红素检测结果的质量大致上问题不大（除非产品质量低劣或仍然使用非胆红素的化学色素为标准）。DPD法(2，5-二氯苯重氮四氟硼酸盐法)DPD法试剂盒复溶后保存时间不长。该法测定总胆红素呈色为红色，易受溶血的干扰，对脂血的抗干扰性好。重氮盐：2，5-二氯苯重氮四氟硼酸盐HCL,表面活性剂WahlefeldAW,HerzG,BerntE.ModificationoftheMalloy-Evelynmethodforasimple,reliabledeterminationoftotalbilirubininserum.ScandJClinLabInvest1972;29Suppl126:Abstract11.12.主波长：570nm吸收峰：紫色RocheBIL-T(ACN101)总胆红素试剂，抗干扰：H<75，L<50改良Malloy-Evelyn重氮法MalloyHT,EvelynKA.Thedeterminationofbilirubinwiththephotoelectriccolorimeter.JBiolChem1937;119:481-490WahlefeldAW,HerzG,BerntE.ModificationoftheMalloy-Evelynmethodforasimple,reliabledeterminationoftotalbilirubininserum.ScandJClinLabInvest1972;29Supplement126:Abstract11.12.重氮盐：

氨基磺酸和重氮基离子，醋酸钠，HCL，表面活性剂主波长：550nm吸收峰：紫红色1972WahlefeldAW试剂稳定性好，抗溶血及脂血的干扰性好。RocheTBILI(ACN294)总胆红素试剂抗干扰:H<1000，L<0100J-G法

Jendrassik&Grof法（1938年）重氮盐：对氨基苯磺酸EDTA，NACl，亚硝酸钠主波长：546nm吸收峰：紫红色RocheDBIL(ACN294)总胆红素试剂，抗干扰:H<25，L<140JendrassikL,GrofP.VereinfachtephotometrischeMethodenzurBestimmungdesBilirubins.BiochemZ1938;297:81-89.改良J-G法（IFCC参考方法）

改良J-G法2004年确认为参考方法，其灵敏度、准确度和特异性均较高，但显色时间相对较长。Jendrassik&Grof法（1938年）由Doumas领导的AACC小组提出改良J-G法(1983)。重氮盐：对氨基苯磺酸HCL，亚硝酸钠，碳酸氢钠主波长：546nm吸收峰：紫红色RocheDBIL1(ACN659)总胆红素试剂，抗干扰:溶血干扰，L<100LoDH,WuTW.AssessmentofthefundamentalaccuracyoftheJendrassik-Gróftotalanddirectbilirubinassays.ClinChem1983;29:31-36.改良间氨基苯磺酸重氮法

重氮盐：3,5间氨基苯磺酸磷酸，HEDTA，NaClRocheBILD2(ACN734)总胆红素试剂，抗干扰:H<25，L<750Roche于2012年上市试剂开瓶稳定期为6周，加强了δ胆红素的检测，抗干扰能力得到了提升。主波长：546nm吸收峰：紫红色改良间氨基苯磺酸重氮法vs改良JG法

重氮盐：3,5间氨基苯磺酸－2,5对氨基苯磺酸

缓冲体系：磷酸，HEDTA，NaCl（PH1.9）

HCL，亚硝酸钠，碳酸氢钠（PH1.2）主要特点。缓冲体系的PH值略有升高，减少了胆红素的自然氧化。更新缓冲体系，减少与白蛋白结合的游离胆红素溶解在反应体系中。重氮盐由对位改为间位，让重氮反应更加平稳。提高了δ胆红素的结合能力。---优势试剂开盖上机稳定性总体增加，可达6周。抗溶血和脂血干扰能力得到了提升。肝素干扰不会导致假性偏的检测。低的测试结果，适用于新生儿样本。准确度增加，可最大程度避免“直接胆红素浓度>总胆红素浓度”的矛盾检测结果。均为即用型试剂盒，不需要手工制备。改良间氨基苯磺酸重氮法

二甲亚砜（DMSO）法DMSO法的最大优点为反应时间短，呈色后稳定性极佳（可稳定近2小时）对脂血抗干扰性较强，受溶血干扰较轻血红蛋白＞3.5g/L时依然有较大的干扰只能测定总胆红素胆红素氧化酶（BOD）法胆红素氧化酶（BOD）在碱性环境中可氧化所有胆红素成分，包括大部分（＞85%）的Bδ，这一特性可用于总胆红素测定。在酸性条件下，mBc、dBc和大部分Bδ均被氧化，只有Bu不被氧化，这一特性可用于Bc（结合胆红素或直接胆红素）的测定。可根据不同胆红素反应的最适pH差别，可分别定量测定总/直胆。特异性强、灵敏度高、重复性好，对溶血、脂血等抗干扰性强，操作简单，适用于自动化测定等。但该法所涉及的工具酶价格昂贵，故商品试剂价格昂贵。胆红素氧化酶容易受到血清蛋白，尤其是白蛋白的影响，这主要由于作为底物的胆红素在掺入血清白蛋白的α螺旋链时，底物便不能接近酶分子中的活性中心（这一现象称为立体障碍）。与血清白蛋白结合的δ胆红素在保持白蛋白α螺旋链的pH范围内对胆红素氧化酶的作用有抵抗性。氧化酶法特异性较好，但酶的来源、纯度、稳定性等问题，目前较少使用钒酸盐法1993年日本和光开发出商品钒酸盐胆红素氧化法试剂。缺点：与d胆红素的反应不充分，血清中胆绿素也会干扰到胆红素的检测，直接胆红素，溶血对测定值会有负误差。钒酸盐环保问题。DoumasBT,YeinF,PerryB,etal:Determinationofthesumofbilirubinsugarconjugatesinplasmabybilirubinoxidase.ClinChem45:1255-1260,1999Tbil检测PH＝8，主波长450nm，吸收峰：黄色DBIL检测PH＝4，主波长450nm，吸收峰：黄色PH＝10时，选择性氧化双葡萄糖醛酸脂和5%的的非结合胆红素，但不包含d胆红素，血清中胆绿素也会干扰到胆红素的检测。优点：试剂稳定性好，抗干扰能力强。BILD2vsDBIL1vsWako钒酸法

BILD2DBIL1WAKODBIL检测方法改良间氨基苯磺酸法改良JG法（参考方法）钒酸盐法开瓶稳定期6周14天4周溶血干扰H<25H<25溶血负误差脂血干扰L<750L<100脂血几无干扰吸收峰紫红色紫红色黄色低值结果准确性优良差(血清本底对低值结果干扰）d胆红素检测能力优良差试剂环保性良良差（人体钒酸盐中毒）线性范围0.09-170.1-100.04-20精密度1.9%2.0%5%（>1mg/dL)准确度偏差4.8%4.8%20%（>1mg/dL)强生Vitros干片法胆红素检测2种干片（TBil/Bubc），

2种方法学（重氮法/光谱法）TBIL干片：重氮反应以J-G方法为参考方法使用540nm和

460nm波长BuBc干片：胆红素组分-分光光度法以HPLC方法参考方法使用400nm和460nm波长[TBIL]=[Bu]+[mBc]+[dBc]+[Bdelta]TBIL干片检测胆红素的全部组分Vitros胆红素的分析方法—Tbil干片地城[BuBc]=[Bu]+[mBc]+[dBc]

检测的BU

检测的BCVitros胆红素的分析方法—BuBc通过酶染剂增强游离胆红素的反射光强度。通过不同的反射光谱测量，一张干片同时检测Bu和Bc。由于δ胆红素分于体积较大而被阻止在扩散层而无法到达反射层。所BUBC干片不直接测定δ胆红素。

δ胆红素＝TBII－BUBC胆红素主要内容

胆红素的代谢胆红素的分类和临床应用胆红素的检测方法罗氏胆红素试剂盒特点胆红素检测的标准化12144336216P模块小包装

12144492216/12144506216D模块大包装

BIL-TACN101－DPD重氮法检测原理在洗涤剂作用下释放出间接胆红素。随后总胆红素在强酸性条件下（pH值1–2）与2,5-二氯苯基重氮盐耦合形成偶氮胆红素。胆红素+重氮离子−−−−→偶氮胆红素形成的红色偶氮染料的色强度与总胆红素浓度成正比，光度计测定。试剂-工作溶液R1表面活性剂；盐酸：100mmol/LR2，R2a表面活性剂；盐酸：100mmol/L；2,5-二氯苯基重氮盐：3.0mmol/L稳定性：R1：即用型42天R2：配制好后14天11822713190P模块小包装

11877941190/11877950190DP大包装

TBILIACN018－改良Malloy-Evelyn重氮法检测原理在加入适合的增溶剂后，总胆红素与酸性介质中的重氮离子相结合。胆红素+重氮离子−−−−→偶氮胆红素生成的偶氮胆红素颜色强度与总胆红素浓度成比例，光度计测定。试剂-工作溶液R1 C2H3NaO2（乙酸钠缓冲液）：85mmol/L；H3NO3S（氨基磺酸）：110mmol/L；表面活性剂；增溶剂R2

HCl：100mmol/L；重氮离子：3mmol/L稳定性：R1：即用型35天R2：即用型35天11555413216P模块小包装

BIL-DACN294－JG法检测原理重氮化对氨基苯磺酸（对氨基苯磺酸与酸化亚硝酸钠反应产生）与胆红素反应形成偶氮胆红素。在直接胆红素检测中，仅有结合胆红素与重氮化对氨基苯磺酸反应。胆红素+重盐离子−−−−→偶氮胆红素所形成的红色偶氮染料的颜色强度与直接（结合）胆红素浓度成正比，可采用光度计进行测量。试剂-工作溶液R1 EDTA：1.5mmol/L；NaCl：152.5mmol/L。R2 2,5二氨基苯磺酸（对氨基苯磺酸）：29mmol/L；盐酸：170mmol/LR2a 亚硝酸钠：25mmol/L.稳定性：R1：即用型6周

R2：配制后7天11986660018/11986651018因子法大包装

DBILI大包装ACN659－改良JG法比色法•样本加入R1，

加入R2并开始反应：重氮化对氨基苯磺酸（对氨基苯磺酸与酸化亚硝酸钠反应产生）与胆红素反应形成偶氮胆红素。在直接胆红素检测中，仅有结合胆红素与重氮化对氨基苯磺酸反应。胆红素+重盐离子−−−−→偶氮胆红素所形成的红色偶氮染料的颜色强度与直接（结合）胆红素浓度成正比，可采用光度计进行测量。试剂-工作溶液R1 盐酸：50mmol/LR2 对氨基苯磺酸：25.7mmol/L；盐酸70mmol/L,亚硝酸钠：2.7mmol/L，碳酸氢钠13.9mmol/L稳定性：R1：即用型至有效期，R2:配制后14天因子法：使用mg/dL单位保留两位小数K因子=2510理论因子：使用umol/L单位，保留一位小数2510X17.1/10=4292.1，经验设置成550005589037190新一代直胆试剂盒

BILD2ACN734－改良间氨基苯磺酸法检测原理重氮化间氨基苯磺酸（间氨基苯磺酸与酸化亚硝酸钠反应产生）与胆红素反应形成偶氮胆红素。在直接胆红素检测中，仅有结合胆红素与重氮化对氨基苯磺酸反应。胆红素+重盐离子−−−−→偶氮胆红素所形成的红色偶氮染料的颜色强度与直接（结合）胆红素浓度成正比，可采用光度计进行测量。试剂-工作溶液R1 磷酸：85mmol/L，HEDTA:4.0mmol/L，NaCl:50mmol/L;表面活性剂pH1.9R2 3.5间氨基苯磺酸：1.5mmol/L；pH1.3稳定性：R1:即用型6周，R2即用型：6周货号代码ACN代码试剂成分及方法名称规格包装人份开瓶稳定期使用模块线性mg/dL干扰主/次波长主波长颜色1214449221612144506216BIL-T1012，5-二氯苯重氮四氟硼酸盐,HCL,表面活性剂

（DPD重氮法）总胆红素

T-BilirubinModD-DPDR1:4x653mlR2:4x146ml;

R2a:4x14614040tests14天D0.1-30H<75L<50570/700紫色12144336216R1:4x66;R2:4x16mL;

R2a:4x16ml1240testsP1187794119011877950190TBILI018氨基苯磺酸，醋酸钠，HCL，表面活性剂（改良Malloy-Evelyn重氮法）总胆红素

BilirubintotalR1:6x250mlR2:6x80ml6780tests5周DP0.1-35H<1000L<1000546/700紫红色11822713190R1:6x62;

R2:6x19ml1400testsPWakoTotalBil开放表面活性剂，钒酸（钒酸盐氧化法）和光矾酸盐法总胆红素试剂盒R1:4x49ml;

R2:4X15ml

4周P0.04-40溶血几无影响450/546黄色11986660018DBIL16592,5对氨基苯磺酸，HCL，亚硝酸钠，碳酸氢钠（改良JG重氮法）直接胆红素(K因子)

DirectBilirubin(D-BILI,Kfactor)2位小数

K因子

mg/dL2510;umol/L42921R1:6x244mlR2:6x64;

R2a→6x64ml7500tests14天DP0.1-10溶血干扰

L<100570/660紫色12217716001R1:6x62;R2→6x15;

R2a→6x15ml1500testsP11555413216DBIL2942,5对氨基苯磺酸，EDTA，NACl，亚硝酸钠（Jendrassik-GrOf重氮法）直接胆红素检测试剂盒

BilirubindirectCoMeHIT917R1:5x17ml;

R2:5x6;R2a:1x3ml400tests7天P0.1-10H<25L<140546/700紫红色BILD27343,5间氨基苯磺酸，磷酸，HEDTA，NaCl（改良3,5间氨基苯磺酸重氮法）直接胆红素检测试剂盒

BilirubindirectGen.2ModPR1:4x66ml;

R2:4X17ml1216tests6周P0.09-17H<25L<750546/800紫红色WakoDireBil开放表面活性剂，矾酸（钒酸盐氧化法）和光矾酸盐法直接胆红素试剂盒R1:4x38ml;

R2:4X11ml

4周P0.04-20溶血负误差450/546黄色物质对光的选择性吸收－吸收互补光溶液之所以呈现不同的颜色，是与它对光的选择性吸收有关。当一