分子流行病学在疾病预防控制中的应用-预防05级

分子流行病学进展及其在疾病预防控制中的应用

MolecularEpidemiologyand

itsApplicationinDiseasePrevention&Control沈洪兵南京医科大学公共卫生学院分子流行病学的定义

（MolecularEpidemiology）分子流行病学是阐明疾病和健康状态相关生物标志（或分子事件）在人群和生物群体中的分布及其影响因素，并研究防制疾病、促进健康的策略与措施的科学。应用先进的技术测量生物学标志的分布情况，结合流行病学现场研究方法，从分子或基因水平阐明疾病的病因及其相关的致病过程。Cancer传统流行病学（宏观、群体）Exposure传统流行病学和分子流行病学

？分子流行病学传统流行病学分子流行病学传统流行病学与分子流行病学的关系（EDC模型）（Schulte,1993）暴露疾病暴露疾病？

前瞻性研究回顾性研究MedicalPracticeetiologydiagnosistreatmentprevention分子流行病学？Genediscovery&CharacterizationSNPsHaplotypesHumanGenomeProjectHapMapProject

分子流行病学的特点与传统流行病学不同研究的水平不同所解决的问题不同与分子生物学的区别研究对象不同（人群）研究内容和方向不同（强调与宏观暴露的关系）研究方法不同（流行病学思维和方法）宏观与微观相结合！分支肿瘤分子流行病学传染病分子流行病学

……分子流行病学的发展趋势研究手段越来越多,技术越来越成熟研究内容(生物标志物)越来越丰富应用范围越来越广（病因、危险度评估、早期诊断、个体化治疗）

生物标志（biologicalmarkers,biomarkers）是可以测量的、能代表生物结构和功能的大分子物质，如DNA、RNA(miRNA)或抗原、抗体、蛋白质（酶）等。分子流行病学的主要研究内容：生物标志一、暴露标志（exposuremarker）（一）外暴露标志

主要指环境因素暴露，包括生物性因素和非生物性因素1、生物性病原因子的鉴定2、病原生物进化变异规律（进化树）3、环境化学污染物（非生物因素）暴露

（二）内暴露标志1、传染性疾病：感染状况、抗原抗体检测、病原体基因监测2、慢性非传染性疾病内暴露剂量、生物效应剂量内暴露剂量包括对化学毒物、饮食中的营养素和可能致癌剂以及微生物感染的测定。例如：吸烟

-血或尿中的烟草代谢产物可替宁浓度（Cotinine）多环芳烃

-尿中的1-羟基芘水平饮食暴露-黄曲霉毒素B1(AFB1)和尿中N-亚硝基化合物（N-nitrosocompounds）的浓度、血液中营养素水平工作暴露和环境污染-血清或脂肪组织中的杀虫剂DDT（dichloro-diphenyl-trichloroethane）、多氯联苯PCBs（polychlorinatedbiphenyl）、二氧杂芑（Dioxins）环氧化物含量吸烟和环境污染-尿中的致突变因子（mutagenicity）的测定。体内剂量标志可替咛（Cotinine）香烟中的尼古丁体液铅环境中的铅体液和组织（发、指甲、牙齿）二氯二苯二氯乙烯二氯二苯三氯乙烷脂肪组织黄曲霉素食物原料体液生物学标志环境暴露物质生物材料1-羟基芘

尿液多环芳烃(PAHs)生物有效剂量标志DNA加合物苯并（a）芘、亚硝胺白细胞生物学标志环境暴露物质生物材料蛋白质加合物（血红蛋白）环氧乙烯红细胞二、效应标志（effectmarker）传染病酶学的改变，血液生化（免疫）指标的变化

病原体基因的整合慢性非传染性疾病（危险性预测）

主要是基因毒性标志物，包括癌基因激活、点突变和染色体异常基因表达异常和代谢异常基因突变或染色体畸变

生物学效应标志染色体诱变化学物

畸变

白细胞姊妹染色体单体交换

白细胞微核（micronuci）

上皮点突变诱变化学物

HGPRT*

白细胞胸苷激酶

白细胞癌基因激活

化学致癌原[苯并（a）芘]组织原嘌呤比例升高铅红细胞生物学标志环境暴露物质生物材料乙酰胆碱脂酶降低有机磷杀虫剂

血浆三、易感性标志（环境-基因）（一）遗传性疾病HNPCC,BRCA1/2（二）慢性病（易感性分子标志物）DNA修复通路（肺癌、肠癌）代谢酶系统（膀胱癌）（三）传染病免疫系统（HLA）炎症通路α1抗胰蛋白酶吸烟肺气肿N-乙酰基转移酶芳香胺膀胱癌生物学标志*暴露疾病芳香烃羟化酶吸烟肺癌宿主易感性标志（非传染病）传染病慢性丙肝病人中，HLA-B44出现频率高达30%以上对白喉毒素敏感的基因定位在5号染色体长臂对脊髓灰质炎病毒敏感性基因定位在19号染色体长臂WhatisaSNP?基因多态性AmutationintheDNAsequencewithafrequencyof>1%遗传性多态性标志物人类基因组计划研究结果表明，不同个体的基因99.9%是一样的，但在序列上有极小(0.1%)的遗传差异，其中主要是SNP。SNP是指在人群中出现的频率1%的先天突变。SNP存在于整个人类基因组中，可能每100~300bp就存在一个SNP，估计总数在数百万个。研究表明，正是这0.1%的差异授予你我他特有的表型；这个小小的差异还与个体对疾病(包括肿瘤)的易感性、对药物的反应性差别有密切关系。单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)人类基因组计划(HGP)基因组多态性数据库(SNPs)HumanGenomeProjectBiologyResponseDiseasePreventionCollinsetal.,Nature,2003SNPsSNPS=SingleNucleotidePolymorphisms人类基因组计划单核苷酸多态与人类个体差异单核苷酸多态与个体疾病易感性差异CancerExposureCancer-freeCIRby70yrsM:15.9%F:9.5%(Peto,BMJ,2000)Geneticsusceptibility?Screening,prevention研究问题1:Whyonly<20%smokersdeveloplungcancer?SNPs？NSCLCNoresponseResponseChemotherapySNPs&ChemosensitivitySNPs？研究问题2:Whysomelungcancerpatientshavenoresponsetochemotherapy?基因检测-危险度评价从科学研究临床实践人类基因组流行病学

1998年由Khoury和Dorman提出人类基因组流行病学(humangenomeepidemiology,HuGE)的概念，定义：应用流行病学与基因组信息相结合的研究方法，开展以人群为基础的研究，评价基因组信息（基因或基因变异及其相应编码的产物）对人群健康和疾病的流行病学意义。分子流行病学常用技术及方法核酸技术（DNA&RNA）核酸体外扩增（PCR）核酸电泳图谱核酸酶切电泳图谱（RFLP）扩增片断长度多态性（AFLP）核酸分子杂交有原位杂交、斑点杂交、转印杂交（包括Southernblot检测DNA和Northernblot检测RNA）等。核酸序列分析蛋白质技术蛋白质分离鉴定技术主要有：电泳、凝胶电泳、蛋白质转印杂交（Westernblot）、色谱分析、蛋白质测序等。酶学技术包括定性和定量检测，要求一定的条件。

多位点酶电泳（multilocusenzymeelectrophoresis,MEE）法。免疫学技术：酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光免疫试验（FIA）、放射免疫试验（RIA）、免疫细胞化学检测（ICC）等；色谱（质谱）技术：高效液相色谱技术HPLC）、液相蛋白色谱技术（FPLC）等。PCR-RFLPPCR-SSCP,PCR-basedresequencingReal-timePCRMatrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flight(MALDI)massspectrometryDynamicallele-specifichybridization(DASH)DNA-chipanalysisDHPLC单核苷酸多态性（SNP）检测技术illumina高通量基因分型平台SNPstream基因分型系统AutomatedLiquidHandlerSpectroPREPTMNanoliterDispenserSpectroJETTMMALDI-TOFMassSpectrometerSpectroREADERTMAutomatedAnalysisSpectroTYPERTMMiniaturizedBiochipSpectroCHIPTMMassARRAYIntegratedComponents核酸分子杂交蛋白质检测鉴定系统SDS酶联免疫吸附试验（ELISA）高效液相色谱(HPLC,LC/MS/MS)AccessibleGenomeandGeneticVariationdatabaseAffordableHigh-throughputPlatformService分子流行病学在疾病预防和控制中的应用（一）病因的探讨及病因致病机制的研究

1、传染病病因及流行规律的探讨研究已知或新发传染病的病原体和流行特点

病原学诊断（基因诊断）、基因分型研究分布特点，传染源追踪和传播途径确定观察病原体在体内持续时间和消长规律丙型肝炎病毒基因分型Simmonds双等级基因命名系统病原体基因分型不同基因型HCV，其临床表现以及对抗病毒治疗的敏感程度有显著差异。1b型对干扰素治疗的持续应答率为20%，而非1b型对干扰素治疗的持续应答率可达60-70%。1a,1b

2a,2b,3a1a,1b

2a,2b,2c,3a45a1b1b,61b,3a1b,3a3b4ClinicalMicrobiologyReviews,2000,13(2)223-235HCV1b型是我国主要流行型1a,1b,2b,3a2a如SARS在广东流行可分三个阶段:早期由病人分离到的SARS病毒与果子狸分离到的SARS病毒高度同源,因此怀疑SARS是一种动物来源的疾病。上海预防医学杂志2005SARS病毒来源及变异分析中期SARS病毒分子结构稳定,病毒传播力强,超级传播事件发生多。后期SARS病毒碱基缺失可达几百个，病毒的传播力大大减少。案例：1990年7月，美国佛罗里达州一名AIDS妇女，怀疑在当地一牙科诊所手术时感染了HIV，因为该诊所的牙科医生也是一名AIDS患者。随后当地卫生部门对该牙医诊治过的一千余名患者进行HIV检测，共发现7名HIV感染者有在该诊所的就诊史。那么这7名HIV感染者是否与该牙医有关呢？传染病传播途径分析Science1992针对这一问题可采取的分析方法：1、传统流行病学分析方法：接触者调查，分析感染者可能的危险行为如输血、静脉吸毒、不洁性交史等。2、分子流行病学方法：比较HIV病毒基因序列的差异，分析不同病例感染株遗传关系的远近。Science1992与牙医感染株的遗传变异性比较与对照感染株的遗传变异性比较病人D当地对照牙医及病人A,B,C,E,G病人F进化树分析以结核为例：与结核病人密切接触，感染和发病的危险增加。这些接触者与源病例之间，是否产生了结核分枝杆菌的传播？开展结核病成“簇”性研究，可以从分子角度解答这样的问题。成簇的过程就是用聚类分析对分离株的基因进行分型或分群的过程，可以分析结核病的传染源和传播途径。揭示传染病传播机制结核杆菌DNA指纹图谱有助于基因分型

流行病学常用结核杆菌基因分型方法IS6110-RFLPSpoligotyping

MIRU-VNTR

Bauer等对丹麦1549株结核菌进行IS6110为基础的DNA指纹分析，成簇率49%。同样方法检测格陵兰岛成簇率为79%。JClinMicrobiol,1998Beijing家族结核菌株在全球的分布江苏省北部地区(苏北)在2003年1-7月爆发了较大规模的无菌性脑膜炎,涉及范围之广、发病人数之多,在国内较少见。不明原因疾病爆发调查疾病暴发原因分析问卷调查收集基本资料血清学检测病原体分离培养Echo30型肠道病毒感染病毒序列测定和比对均为Echo30型肠道病毒。进化树分析显示分离株与国外1999年和2000年分离株的亲缘关系最近；但自成一簇，与国外毒株存在地区差别。2、非传染病的病因及病因致病机制的研究例：载脂蛋白与心血管疾病HBV感染与肝癌（基因组整合）EBV感染与鼻咽癌HPV感染与宫颈癌HP感染与胃癌

心脑血管病的研究载脂蛋白与心血管疾病四组老年人apooA-I、apoB-100与apoA-I/apoB-100比值人群类别检测例数apoA-I（mg/dl）apoB-100（mg/dl）apoA-I/apoB-100对照组85148.2±30.197.3±28.31.58±0.8冠心病组146141.6±51.9113.9±35.8**1.40±0.7**高血压组90135.1±32.9*107.0±59.2**1.44±1.07**高血压并冠心病组57140.2±31.3110.9±34.2**1.41±0.8**注：病例组与对照组相比*P<0.05；**P<0.01HBV肝癌正常人HBV感染正常:HBV肝癌AUC:99.9±0.1%2/5灵敏度:0.969特异度:0.994HBV:HBV肝癌AUC:99.2±0.6%MiRNA谱(Profile)例：恶性肿瘤的形成过程及其影响因素前致癌物终致癌物DNA损伤基因突变癌前病变恶性肿瘤活化解毒凋亡增生修复损伤遗传易感性因素（二）疾病易感性的测定

（传染病和非传染病）测定疾病易感性，可以进行高风险人群筛选，采取更有效的预防和控制措施高危险易感基因（高外显性）连锁研究(linkage!)如BRCA1、BRCA2与乳腺癌（40-80％）一般人群中频率<1％，RR和AR高，PAR较低！低危险易感基因（低共显基因）

相关性研究（association！）如代谢酶基因（I相、II相）DNA修复基因细胞周期调节基因等SmokingCausedDNADamageandRelatedRepairPathwaysDNArepairgeneSNPs（genotypes）DRC（Phenotype）LungCancerRisk

Association？Hypothesis:

ThegeneticpolymorphismsoftheDNArepairgenesareassociated,

independentlyorcoordinately,withincreasedriskoflungcancerGene-environmentinteraction?Subjects&MethodsHospital-basedcase-controlstudiesoflungcancer

InclusionCriteria

Cases:Incident

lungcancerpatientsNewlydiagnosed,histopathologically

confirmed

Noprevious

radiotherapy

or

chemotherapy

Controls:

Cancer-freesubjectsRecruitedatthesametimeperiodascasesand

frequentedmatchedtothecasesonage,sexAllthesubjectsareHanChinese(Nanjing).

PotentiallyfunctionalSNPs

ofDNArepairgeneXRCC1andriskoflungcancer

HuZ,…ShenH.

Pharmacogenetics&Genomics200515(7):457-64.

Acase-controlstudyof710lungcancercasesand710cancer-freecontrolsExample1FunctionalpolymorphismsofDNArepairgeneXRCC1:

Promoter:

T-77C(2004)

Codingregion:

Arg194Trp(C>T)

(DNApol,PARPdomain)

Arg399Gln(G>A)

(PARPdomain)

EXON1234567891011121314151617

XRCC15’UTRATG3’UTR-77T>CExon6Arg194Trp

Exon10Arg399Gln+1-77TXRCC1

promoter-1152+93LuciferaseXRCC1promoter-1152+93LuciferasepGL3-77CpGL3p77Tp77CKpnINheIChromosome:19q13.21246-bp57–64%DistributionofSelectVariablesandXRCC1VariantAllelesinLungCancerCasesandCancer-freeControlsXRCC1T-77CPolymorphismandLungCancerRiskHuZ,

…ShenH.

Pharmacogenetics&Genomics200515(7):457-64.

XRCC1T-77CandCumulativeSmokingPack-yearsofsmoking-77TT-77CT/CCAdjustedORHuZ,

…ShenH.

Pharmacogenetics

&genomics200515(7):457-64.Pvalueforthetestofadditivegene-smokinginteraction:0.027

Thissignificantassociationwithlungcancerwasvalidatedinanotherindependentcase-controlstudyinaChinesepopulationHaoetal.2006OncogeneGWAS（三）疾病防治措施的研究

1、传染病的预防（1）新疫苗的研制—核酸疫苗（2）研究疫苗预防效果—与疫苗无应答的关系，如对乙肝疫苗低应答或无应答人群中，白种人和日本人携带HLA-DR3和HLA-DR7比率较高；而中国人HLA-DR14-DR52基因的携带率较高（3）疫苗株引起的感染2、非传染病的防治作为抗氧化剂的胡萝卜素可减少或防止DNA的损伤叶酸可改变DNA甲基化或减少染色体断裂（四）疾病诊治效果和预后评价1、治疗效果评价从分子水平研究药物治疗后体内某些指标的变化情况（传染病和非传染病）2、疾病预后的评价胃癌病人nm23基因、P27KIPI基因、TGF-BRI基因表达与生存率的关系，结果发现，癌组织内上述基因高表达组手术后3年和5年生存率均高于低表达组或阴性组

我国2000年全国流调结核菌耐药状况初始耐药：18.6%

初始耐多药率：7.6%获得性耐药：46.5%

获得性耐多药率：17.1%总耐药：27.8%

总耐多药率：10.7%miR-196a2rs11614913多态性与肺癌生存率(CCvsCT/TT)HuZ…ShenH.JournalofClinicalInvestigation,July,2008IF=16.9(A)MMP9Arg279GlnandNSCLCsurvival(P=0.03);(B)MMP9Arg668GlngenotypesandNSCLCsurvival(P=0.01);(C)CombinedeffectofMMP9Arg279GlnandArg668