第三章 药物的杂质检查

第三章药物的杂质检查1.掌握杂质检查中限量的表示方法及计算。2.掌握一般杂质与特殊杂质的定义。3.掌握氯化物、重金属、砷盐检查的原理、方法、条件及注意事项。4.掌握色谱法在特殊杂质检查中的应用。5.熟悉药物中杂质的来源和杂质检查方法。6.熟悉硫酸盐、铁盐、残留溶剂测定、干燥失重检查、炽灼残渣测定法。7.了解药物纯度的概念，明确药物中杂质检查的意义；了解澄清度、溶液颜色、易炭化物检查的原理及方法；了解特殊杂质检查的其他方法。第一节概述一、药物纯度的概念与要求杂质？药物的纯度？药物的纯度与化学试剂的纯度的不同？任何影响药品纯度的物质。指药物纯净程度。药物的纯度：从用药安全、有效和对药物稳定性的影响来考虑化学试剂的纯度：从可能引起的化学变化对使用的影响考虑，不考虑杂质的生理作用二、杂质的来源与种类㈠生产过程中引入1.在合成药的生产过程中，未反应完全的原料、反应的中间体和副产物。如：阿司匹林

2.药物在制成制剂过程中，可能产生新的杂质。如：盐酸普鲁卡因注射液在高温灭菌过程中，可能水解为对氨基苯甲酸和二乙氨基乙醇。

3.试剂、溶剂、催化剂类。如残留溶剂

4.生产中所用金属器皿、装置以及其他不耐酸、碱的金属工具所带来的杂质。如：金属杂质必须重视异构体和多晶型对药物有效性和安全性的影响㈡贮藏过程中引入的杂质在贮藏过程中由于受外界条件(温度、湿度、日光、氧气、微生物等)的影响，引起药物结构发生变化(水解、氧化、分解、异构化、晶形转变、聚合、潮解和发霉等)而产生杂质。易发生水解反应的结构：酯、内酯、酰胺、卤代烃、苷类等易发生氧化反应的结构：醚、醛、酚羟基、巯基、亚硝基、双键等㈢杂质的种类按来源分一般杂质、特殊杂质按毒性分信号杂质、毒性杂质按理化性质分无机杂质、有机杂质、残留溶剂特殊杂质：指在特定药物在生产工艺中引入的杂质。一般杂质：指在自然界中分布较广泛，在多种药物的生产和贮藏过程容易引入的杂质。如酸、碱、水分、氯化物、硫酸盐、砷盐、重金属等三、杂质的限量

杂质限量：在不影响疗效和不发生毒性的前提下，对于药物中可能存在的杂质，允许有一定的量。药物中所含杂质的最大允许量称为杂质限量。限量的表示方法：百分之几(%)

百万分之几（ppm）杂质限量（%）=杂质最大允许量供试品量×100%杂质检查方法：限量检查法、定量测定法限量检查法分为：对照法、灵敏度法、比较法对照法：指取一定量的被检杂质标准溶液和一定量供试品溶液，在相同条件下处理，比较反应结果，以确定杂质是否超过限量。对照液供试液相同方法处理比较结果特点：不需知道杂质的准确含量L(%)=C×VS×100%杂质限量(%)=标准溶液浓度×标准溶液体积供试品量×100%灵敏度法：指在供试品溶液中加入一定量的试剂，在一定反应条件下，不得有正反应出现，从而判断供试品中所含杂质是否符合限量规定。比较法：指取供试品一定量依法检查，测定特定待检杂质的参数与规定的限量比较，不得更大。示例一奈苯海明中氯化物的检查取本品0.30g置200ml量瓶中，加水50ml、氨试液3ml和10%硝酸铵溶液6ml，置水浴上加热5min，加硝酸银试液25ml，摇匀，再置水浴上加热15min，并时时振摇，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，放置15min，滤过，取续滤液25ml置纳氏比色管中，加稀硝酸10ml，加水稀释成50ml，摇匀，在暗处放置5min，与标准氯化钠溶液(10gCl/ml)1.5ml制成的对照液比较，求氯化物的限量。L(%)=C×VS×100%25200=10×10-6×1.50.30××100%=0.04%示例二

谷氨酸钠中重金属的检查取本品1.0g，加醋酸盐缓冲液（pH3.5）2ml，依法检查，与标准铅溶液（10gPb/ml）所呈颜色相比较，不得更深，重金属不得超过百万分之十。应取标准铅溶液多少毫升？V=L×SC=10×10-6×1.010×10-6=1.0ml示例三

肾上腺素中酮体的检查取本品0.20g，置100ml量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）溶解并稀释至刻度，摇匀，在310nm处测定吸光度不得超过0.05，酮体的为435，求酮体的限量。×100AC酮体＝＝435×1000.05＝1.15×10-6(g/ml)0.2C样品＝100＝2×10-3(g/ml)L(%)=×100%=0.06%C酮体C样品A=×C示例四

卡比马唑片（规格：5mg）中甲巯咪唑的检查取本品20片，研细，加三氯甲烷适量，研磨使卡比马唑溶解，滤过，加三氯甲烷洗涤滤器，合并滤液与洗液，置10ml量瓶中，加三氯甲烷稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取甲巯咪唑对照品，加三氯甲烷制成每1ml含100g的溶液，作为对照品溶液，分别吸取上述两种溶液各10l，点样、展开、显色。供试品溶液如显与对照品相应的杂质斑点，其颜色与对照品主斑点比较，不得更深，求杂质限量。L(%)=×100%=C杂质C样品10010000×100%=1.0%第二节一般杂质的检查方法一、氯化物检查法原理利用Cl-在硝酸酸性溶液中与硝酸银试液作用，生成氯化银的白色浑浊液，与一定量标准氯化钠溶液在相同条件下生成的氯化银浑浊液比较，以判断供试品中的氯化物是否符合限量规定。检查方法供试液对照液稀硝酸暗处放置5min，置黑色背景上，从比色管上方向下观察，比较。硝酸银试液1.0ml测定条件1.标准NaCl溶液10gCl/ml，50ml溶液中含50～80g的Cl所显浑浊梯度明显，相当于标准NaCl溶液5～8ml。2.反应需在硝酸酸性条件下进行，且以50ml供试溶液中含稀硝酸10ml为宜。目的：加速AgCl浑浊的形成并产生较好的乳浊；避免弱酸银盐如碳酸银、磷酸银以及氧化银沉淀的形成。3.避光、暗处放置5min后比浊，因氯化银见光易分解。二、硫酸盐检查法原理利用SO42-与氯化钡在盐酸酸性溶液中生成硫酸钡的白色浑浊液，与一定量标准硫酸钾溶液在相同条件下生成的浑浊液比较，以判断供试品中的硫酸盐是否符合限量规定。检查方法供试液对照液25%氯化钡溶液5ml放置10min，置黑色背景上，从比色管上方向下观察，比较。稀盐酸测定条件1.标准K2SO4溶液100gSO42-/ml，50ml溶液中含100g～500g的所显浑浊梯度明显，相当于标准K2SO4溶液1～5ml。2.反应需在盐酸酸性条件下进行，且以50ml供试溶液中含稀盐酸2ml为宜。干扰与排除1.供试品中如有不溶物，用滤纸滤过。2.供试品如有色，用内消色法处理。三、铁盐检查法硫氰酸盐法Ch.pUSP巯基醋酸法BP硫氰酸盐法原理铁盐在盐酸酸性溶液中与硫氰酸盐生成红色可溶性硫氰酸铁配位离子，与一定量标准铁溶液用同法处理后所呈的颜色比较，以判断供试品中的铁盐是否符合限量规定。H+检查方法供试液对照液硫氰酸铵立即比色稀盐酸、过硫酸铵测定条件1.标准铁溶液在(10g/ml)1-5ml范围内，色泽梯度明显，易于区别。2.盐酸酸性条件可防止Fe3+水解(50ml溶液含稀盐酸4ml)。3.加入氧化剂过硫酸铵可氧化供试品中的Fe2+Fe3+，同时防止光线使硫氰酸铁还原或分解褪色。干扰与排除1.若检查葡萄糖、糊精等药物中的铁盐，则需加硝酸处理，不再加过硫酸铵，但要加热煮沸排除亚硝酸的干扰。2.为了提高灵敏度或供试管与对照管色调不一致时，可用正丁醇提取后，分取正丁醇层比色。四、重金属检查法重金属：指在实验条件下，能与S2-作用显色的金属杂质，如银、铅、汞、铜及镉等。在药品生产过程中遇到铅的机会较多，铅在体内易蓄积中毒，所以检查时以铅为代表。《中国药典》重金属检查法一共收载有四法第一法硫代乙酰胺法适用于溶于水、稀酸和乙醇的药物原理硫代乙酰胺在弱酸性(pH3.5醋酸盐缓冲液)条件下水解，产生的硫化氢与微量重金属离子作用生成黄色到棕黑色的硫化物，与一定量标准铅溶液经处理后产生的颜色进行比较。pH3.5检查方法供试液对照液硫代乙酰胺试液2ml放置2分钟，比较醋酸盐缓冲液2ml测定条件1.标准铅溶液(10g/ml)适宜目视比色的范围为1-2ml。2.用2mlpH3.5的醋酸盐缓冲液控制溶液pH值为3～3.5，此时，硫化铅沉淀较完全。3.酸度增大，重金属与H2S呈色较浅或不呈色。干扰与排除1.供试品如有色，在对照管中加稀焦糖溶液或其他无干扰的有色溶液。2.若供试品中有微量Fe3+，会氧化H2S生成单质硫，干扰比色，加入抗坏血酸还原Fe3+为Fe2+，可消除干扰。第二法炽灼后硫代乙酰胺法适用于含芳环、杂环以及不溶于水、稀酸、乙醇及碱的有机药物供试品炽灼盐酸供试溶液对照溶液醋酸缓冲液2ml硫代乙酰胺试液2ml放置2分钟，观察，比较注意1.炽灼残渣加硝酸加热处理，使有机物进一步分解破坏完全，必须蒸干除尽氧化氮，否则可氧化硫化氢析出硫，影响比色。2.含钠及氟的有机药物应用铂坩埚、石英坩埚或硬质玻璃蒸发皿(因可腐蚀瓷坩埚，带入大量重金属。)第三法硫化钠法适用于溶于碱而不溶于稀酸或在稀酸中生成沉淀的药物。如磺胺类、巴比妥类原理将供试品碱性条件下溶解，以硫化钠为显色剂，Pb2＋和S2－作用生成PbS微粒的混悬液，与一定量标准铅溶液经同样处理后的颜色进行比较。检查方法供试液对照液硫化钠试液1ml放置2分钟，比较氢氧化钠试液5ml第四法微孔滤膜法适用于含2～5g重金属杂质及有色供试液的检查按第一法处理后用微孔滤膜过滤，使重金属硫化物沉淀富集于滤膜，比较色斑。检查方法供试液对照液硫代乙酰胺试液1ml醋酸盐缓冲液2ml转移至滤器过滤，取下滤膜，于滤纸上干燥，比较铅斑的深浅。五、砷盐检查法砷为毒性杂质，多由使用无机试剂引入。Ch.p两种检查方法㈠古蔡氏法原理利用金属锌与酸作用产生新生态的氢，与药物中微量砷反应，生成具有挥发性的砷化氢气体，遇溴化汞试纸，产生黄色至棕色的砷斑，与一定量标准砷溶液在相同条件下所生成的砷斑比较，来判断药物中砷斑的含量。检查方法供试液对照液酸性SnCl2KI试液供试品处理As3＋Zn粒AsH3↑HgBr2试纸PbAc2棉花砷斑比较测定条件

1.标准砷溶液临用新配，1gAs/ml。

2.酸性氯化亚锡及碘化钾的作用是：⑴还原As5+为As3+，加快反应速度；⑵碘化钾被氧化生成的I2又可被氯化亚锡还原为I-，I-与反应中生成的Zn2+能形成稳定的配位离子，有利于生成砷化氢的反应不断进行；⑶可抑制微量Sb的干扰，在实验条件下，100gSb存在不干扰。⑷在锌粒表面形成锌锡齐，起去极化的作用。3.醋酸铅棉花的作用是消除锌粒及供试品中少量硫化物的干扰，醋酸铅棉花60mg装管高度60～80mm。4.锌粒应无砷。5.砷斑不稳定，应立即观察干扰与排除1.供试品若为硫化物、亚硫酸盐、硫代硫酸盐时，加HNO3，△，使氧化成硫酸盐，以除去干扰，如硫代硫酸钠中砷盐的检查。2.供试品若为铁盐，需先加酸性氯化亚锡试液，将Fe3+还原为Fe2+。如枸橼酸铁铵中砷盐的检查。3.环状结构的有机药物，要先有机破坏后再检查常用的有机破坏方法：碱破坏法：石灰法、无水碳酸钠碱融法酸破坏法：如葡萄糖中砷盐的检查4.供试品若为含锑药物，改用白田道夫法原理氯化亚锡在盐酸中能将砷盐还原成棕褐色的胶态砷。与一定量标准砷溶液用同法处理后进行比较，判断供试品中含砷量。本法灵敏度低(20gAs2O3/10ml)，加入少量二氯化汞能提高反应灵敏度(2gAs2O3/10ml)。㈡二乙基二硫代氨基甲酸银法[Ag-DDC法]原理砷化氢与Ag(DDC)吡啶溶液作用，使Ag(DDC)中的银还原为红色胶态银。与一定量标准砷溶液相同条件下处理后进行比较红色检查方法供试液对照液酸性SnCl2KI试液供试品处理As3＋Zn粒AsH3↑Ag-DDC吡啶溶液红色胶态银同置白色背景上目视比色或在510nm波长测吸收度，比较大小。锑化氢与Ag(DDC)的反应灵敏度低，500g锑液不干扰测定六、溶液颜色检查法控制药物中有色杂质限量的方法。第一法目视比色法与标准比色液比较的方法检查方法规定色调色号的标准比色液稀释后供试溶液同置纳氏比色管观察、比较观察方法：平视（颜色较深时）自上而下（颜色较浅时）标准比色液的配制由三种有色无机盐(比色用重铬酸钾0.8000mg/ml、比色用硫酸铜液62.4mg/ml和比色用氯化钴液59.5mg/ml）配成。分别取不同比例的以上三种溶液，配成5个色调10个色号的标准比色液。第二法分光光度法取各药品项下规定量的供试品，溶解后过滤，取滤液于规定波长测吸收度，不得超过规定值。第三法色差计法使用色差计测定供试品溶液与水的色差，与标准比色液与水的色差比较。七、易炭化物检查法检查药物中遇硫酸易炭化或易被氧化呈色的微量有机杂质。检查方法供试品5ml硫酸比色管振摇、静置，与比色液比较。比色液1.“溶液颜色检查”项下的标准比色液；2.由比色用氯化钴液，比色用重铬酸钾液，比色用硫酸铜液按规定方法配成的对照液；3.高锰酸钾液。注意事项1.置白色背景下平视比较；2.若供试品为固体，应先研细；若不溶需加热；3.按规定控制硫酸的浓度、反应温度与时间。八、澄清度检查法检查药品溶液的浑浊程度是检查药物中的微量不溶性杂质，用作注射剂的原料药，应作此项检查。检查方法浊度标准液稀释后供试溶液同置比浊用玻璃管同置伞棚灯下，从水平方向观察、比较。中国药典规定用浊度标准液作为澄清度检查的标准浊度标准液的配制

1.00％硫酸肼溶液与10％乌洛托品溶液等量混合配制浊度标准贮备液浊度标准原液浊度标准液（5个级号）稀释稀释原理：乌洛托品在偏酸性条件下水解产生甲醛，甲醛与肼缩合生成甲醛腙，不溶于水，形成白色浑浊。药典中规定的“澄清”，系指供试品溶液的澄清度相同于所用溶剂，或未超过0.5号浊度标准液。注意事项1.光线和温度对混悬液的形成有影响，因此，规定在251C制备浊度标准储备液。2.溶剂：水、酸、碱、有机溶剂有机酸的碱金属盐类药物强调用“新沸过的冷水”3.供制备注射用的原料药物往往既要检查溶液“澄清度”又要检查“溶液颜色”。九、炽灼残渣检查法指有机药物经炭化或挥发性无机药物加热分解后，高温炽灼，所产生的非挥发性无机杂质的硫酸盐检查方法规定量供试品置坩埚精密称定，在电炉上炽灼至炭化冷至室温，加硫酸0.5-1.0ml低温加热高温电炉上炽灼至恒重计算炽灼残渣%＝残渣及坩埚重－空坩埚重供试品重×100%1.中国、美国、英国及日本四个国家的药典对于炽灼残渣恒重的要求不相同，对灼烧温度要求也不一。2.供试品的取用量应根据炽灼残渣限量和称量误差决定。3.为避免供试品灼烧时骤热膨胀溅出，坩埚可斜置，缓慢加热直至灰化。4、在进行高温炉内灼烧前务必将硫酸赶尽，以免硫酸腐蚀炉壁，造成漏电。十、干燥失重测定法指药品在规定条件下，经干燥后所减失的重量，以百分率表示。主要是水分及其它挥发性物质恒重：指供试品连续两次干燥或炽灼后的重量差异在0.3mg以下的重量。炽灼至恒重的第二次以及以后各次称重均应在规定条件下继续炽灼30min后进行。干燥至恒重的第二次及以后各次称重均应在规定条件下继续干燥1h后进行。（一）常压恒温干燥法适用于受热稳定的药物供试品105℃干燥干燥至恒重的扁平称瓶精密称定精密称定干燥至恒重干燥失重%＝称量瓶与加入样品重－恒重后称量瓶与样品重供试品重×100%注意事项1.干燥温度：一般为105ºC，含结晶水的药物可提高温度。2.样品厚度：一般不超过5mm，如为疏松物质，厚度不超过10mm；如为大颗粒结晶，应研细至粒度约2mm。3.放入烘箱中时，应将瓶盖取下，放于称量瓶旁，或将瓶盖半开进行干燥；取出时，须将瓶盖盖好，置干燥器中放冷至室温，然后称定重量。4.药物含有较大量水分，熔点又较低，应先在低温干燥，使大部分水分除去后，再于规定温度干燥至恒重。（二）减压干燥法与恒温减压干燥法适用于熔点低，受热分解的药物采用减压干燥器或恒温减压干燥箱时，除另有规定外，压力应在2.67kPa(20mmHg)以下。温度为60℃。干燥器中常用的干燥剂：无水氯化钙、硅胶、P2O5

恒温减压干燥箱中常用的干燥剂：P2O5

（三）干燥剂干燥法适用于受热易分解或易升华的药物常用的干燥剂：硅胶、浓硫酸、P2O5

。将供试品置于干燥器内，利用干燥器内放置的干燥剂，吸收供试品中的水分，干燥至恒重。（四）热分析法在程序控制温度下测量物质的物理化学性质与温度关系的一类技术。1.热重分析(thermogravimetricanalysis,TGA)记录质量随温度变化的曲线，从而准确的测量物质的质量变化及变化速度。适用于：原料和药品的湿度检查，尤其是贵重或在空气中易氧化药物的干燥失重测定。如：草酸钙2.差热分析测量待测物与参比物间温差与温度关系一种技术。可研究在短时间内样品比热发生较大变化的反应，或体系与环境有较大热交换的反应。如果待测物与参比物热容大致相同，被测物如发生热效应，在热分析曲线上就会有峰出现。因此，差热曲线上吸热、放热峰的个数、形状、位置与相应温度可用于定性鉴别待测物质或其多晶型；亦可检查待测物纯度。3.差示扫描量热法测量传输给待测物与参比物的能量差与温度关系的一种技术。分为功率补停型和热流型两种基本类型。适于：待测物质的鉴别、晶型检查、纯度检查、熔点和水分等的测定。较差热分析法更适于测量物质在化学变化和物理变化过程中焓的变化。十一、水分测定法包括结晶水和吸附水。Ch.p、USP及BP均收载了费休氏法和甲苯法费休氏法原理:利用碘氧化二氧化硫时需要一定量的水参加反应。根据消耗碘的量可以测定出水分含量。试验条件加入无水吡啶和无水甲醇，定量地吸收HI和SO3，形成氢碘酸吡啶和稳定的甲基硫酸氢吡啶。十二、有机溶剂残留量测定法有机残留溶剂：指在合成原料药、辅料或制剂生产过程中使用的，但在工艺中未能完全除去的有机溶剂。中国药典2000版仅对苯等7种有机残留溶剂作出具体规定，2005版附录对此进行较大幅度修订，残留溶剂控制种类和限量与人用药品注册技术规范的国际协调会一致。残留有机溶剂按毒性程度分为三类：一类毒性大，限制使用；二类有一定毒性，限量使用；三类毒性较小，推荐使用，

三类溶剂的残留量应符合表(P62-63)中要求，对其它溶剂应根据生产工艺制定相应的限度。中国药典2005规定检查方法为GC，可采用填充柱亦可用毛细管柱，通常使用FID检测器。对含卤素残留溶剂如三氯甲烷等，采用ECD检测器灵敏度更高。

㈠中国药典法1.系统适用性试验⑴用待测物色谱峰计算，填充柱理论塔板数大于1000,而毛细管色谱柱则大于5000⑵色谱图中，待测物色谱峰与其相邻峰的分离度应大于1.5。⑶以内标法测定时,对照品溶液连续进样5次,所得待测物与内标物峰面积之比的相对标准偏差应不大于5%;若以外标法计算,所得待测物峰面积相对标准偏差应不大于5%.

2.测定方法⑴毛细管顶空进样等温法适于：检查有机溶剂数量不多，且极性差异较小的情况顶空条件选择：据供试品中残留溶剂的沸点选择顶空温度，同时应避免供试品可能产生的挥发性热分解产物对测定的干扰。不适于顶空法测定的残留溶剂：甲酰胺、2-甲氧基乙醇、2-乙氧基乙醇、乙二醇、N-甲基咯烷酮⑵毛细管顶空进样程序升温法：检查有机溶剂数量较多且极性差异较大的情况。⑶溶液直接进样法：采用填充柱或适宜极性毛细管柱。㈡静态顶空进样法（自学）。第三节特殊杂质检查一、色谱分析法㈠薄层色谱法：1.杂质对照品法方法：据杂质限量，其供试品溶液和一定浓度的杂质对照品溶液，分别点样同一硅胶薄层板上，展开、定位、检查，供试品中所含杂质的斑点，不得超过相应杂质的对照斑点。如：枸橼酸乙胺嗪中N-甲基哌嗪的检查。适用于已知杂质并能制备杂质对照品的情况。2.供试品溶液自身稀释对照法适用于杂质的结构不清，或无杂质对照品的情况。仅限于杂质斑点与主成分斑点颜色相同或相近情况下使用.如：吡罗昔康中有关物质的检查方法：将供试品溶液按限量要求稀释至一定浓度作为对照溶液，与供试品溶液分别点于同一薄层板上，展开、定位、检查。供试品溶液所显杂质斑点不得深于对照溶液所显主斑点颜色。当供试品中有多个杂质存在时，可配制几种限量的对照溶液，加以比较。3.杂质对照品法与供试品溶液自身稀释对照法并用：适用于药物中有多个杂质，有的有对照品而有的无对照品的情形。如：硫酸奈替米星中有关物质的检查配制三种浓度的对照溶液，用供试品溶液稀释成标准溶液1、标准溶液2，取西梭米星对照品配制标准溶液3，经与供试品溶液一同点样、展开、定位后，判断：供试液如显杂质斑点，其颜色与标准溶液3所显主斑点相比不得更深；其它杂质与标准溶液1所显主斑点相比均不得更深，如有一个斑点超过，应不深于标准溶液2主斑点。4.对照药物法：当无合适的杂质对照品，尤其是供试品显示的杂质斑点颜色与主成分斑点颜色有差异，难以判断限量时，可用与供试品相同的药物作为对照品，此对照药物所含待检杂质需符合限量要求，且稳定性好。如，马来酸麦角新碱中有关物质的检查方法：用马来酸麦角新碱样品配制高低浓度溶液1、2，用其对照品配制溶液3，分别点于同一硅胶板，展开、定位。判定：溶液1与溶液3比较：主斑点颜色与位置应一致，杂质斑点颜色应不深于3，并不能有3以外的杂质斑点；溶液2除主斑点外，不得显杂质斑点。为保证薄层系统符合要求，中国药典2005增加了系统适用性试验：⑴检测灵敏度：指杂质检查时，采用对照溶液稀释若干倍的溶液与供试品溶液和对照品溶液在规定色谱条件下，在同一薄层板上点样、展开、检视，前者应显示清晰的斑点。⑵比移值：可用比移值说明主斑点或杂质斑点的位置。⑶分离效能：杂质对照品用供试品自身稀释对照溶液或同品种对照溶液溶解制成混合对照溶液的色谱图中，显示两个清晰分离的斑点。㈡高效液相色谱法1.内标加校正因子测定法：用于有对照品的杂质、能够测定杂质校正因子的情况。先进样加有内标物的对照品溶液，测定杂质校正因子方法再进样加有内标物的供试品溶液，求杂质浓度2.外标测定法：用于有对照品的杂质，且进样量可精确控制的情况。方法配制杂质对照品溶液和供试品溶液，分别取一定量注入色谱仪，测定对照品和供试品中杂质的峰面积，按外标法计算杂质的含量。3.加校正因子的主成分自身对照法方法在方法建立时，采用杂质对照品和药物对照品配置一定浓度的溶液，进行色谱分离、分析后，按下式计算所得:进行杂质检查时，可不用杂质对照品。但是建立方法时，需要利用杂质对照品。测定杂质含量时，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当浓度的溶液，作为对照溶液调节仪器灵敏度，使主成分色谱峰高约达满量程的10%-25%，分别取供试品溶液和对照品溶液进样，测量供试品溶液色谱图上各杂质峰面积，将这些峰面积分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质的含量。4.不加校正因子的主成分自身对照法：用于单一杂质含量较少、无法得到杂质对照品因而无法获得校正因子、杂质结构与主药结构相似,其响应因子差别不会太大的情况下。①按规定，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的浓度，作为对照溶液。②分别取供试品溶液和对照品溶液进样，计算供试品溶液色谱图上各杂质峰面积及其总和，与对照溶液主成分峰面积比较，以确定杂质是否超过限量。例：氧氟沙星中有关物质的检查。方法方法：取供试品溶液适量，进样，经高效液相色谱分离、测定后，计算各杂质峰面积及其总和占总峰面积的百分率，不得超过限量。5.峰面积归一法：粗略考察供试品中杂质。在杂质与主成分结构差异较大时,存在测量误差大缺陷，不宜于”微量杂质”检查。主峰杂质1杂质2杂质3溶剂峰㈢气相色谱法如：氯贝丁酯中对氯酚和挥发性杂质的检查与高效液相色谱法相同的有内标法加校正因子测定法、外标法和峰面积归一法测定法，不同的有标准加入法。该法是将一定量杂质对照品溶液精密加入到供试品溶液中，据内标法或外标法测定杂质的含量，再扣除加入的对照品溶液含量，即得供试品溶液中杂质含量。除药物中残留溶剂外，一些挥发性特殊杂质也可采用气相色谱法检查。二、光谱分析法㈠紫外分光光度法：当杂质在某一波长处有