第二章预处理及固液分离技术2

第二节细胞破碎与分离2.1

概述2.2细胞壁的结构及特点2.3细胞壁的破碎2.1概述胞外产物霉菌产生糖化酶等胞内产物基因重组产品等采用机械和非机械的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中。2.2细胞壁的结构及特点微生物：细菌——肽聚糖的网状结构酵母——细胞壁结构交联的紧密程度及厚度真菌——细胞壁的强度和聚合物网状结构植物：主要是网状结构的共价键微生物革兰式阳性菌革兰式阴性菌酵母壁厚（nm）20～8010～25100～300层单层多层多层主要组成肽聚糖(40~90%)肽聚糖(5~10%)葡聚糖(30~40%)多糖脂蛋白甘露聚糖（30％）胞壁酸脂多糖蛋白质磷脂蛋白质脂多糖蛋白质脂类破碎难易程度难相对易最难表2.1各种微生物细胞壁的结构及组成2.3细胞壁的破碎破碎方法的选择：

破碎目的待破碎生物体的类型破碎目的：获取产品，考虑破碎收率和能耗；

待破碎生物体的类型：不同生物体对破碎有不同的敏感度。2.3.1破碎率的评价破碎率的定义：

N0：原始细胞数N：经t时间操作后，保存下来的细胞数N0和N的获取：直接计数法（平板计数，显微镜计数）间接计数法（测破碎细胞释放出活性物质量）电导率测定法3.1x＝R/RmR:破碎后释放的化合物的量Rm:理论最大释放量电导率测定法：细胞破碎后，大量带电荷的物质被释放到水相，使电导率上升，电导率随破碎率的增加呈线性增加。

由于电导率与微生物的种类，处理条件，细胞浓度，温度，悬浮液中电解质含量有关，因此，正式测定应采用其它方法测定标准曲线。2.3.2破碎方法破碎方式机械法非机械法液体剪切作用固体剪切作用干燥处理溶胞作用珠磨法压榨高压匀浆超声破碎酶溶法化学法物理法图2.2细胞破碎方法分类图2.3细胞破碎机理2.3.2破碎方法图2.3HC23-高压细胞破碎机高压匀浆法图2.4DY89-1型电动玻璃匀浆机作用机理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速(可达到450m／s)喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。高压匀浆器的操作压力通常为50～70MPa。

一、高压匀浆法影响细胞破碎的因素：温度压力循环操作次数细胞浓度阀座形式高压匀浆法影响破碎效率的因素温度：破碎率随温度的增加而增加例如：操作温度由5℃增加到30℃，破碎率约提高1.5倍。高温对破碎有利，但应考虑热变性压力每增加10MPa，温度2℃。高压匀浆法影响破碎效率的因素压力：高压匀浆法不能单纯追求高破碎率，随意增加操作压力。影响破碎效率的因素阀座形式：在相同的操作压力下，刃缘阀座比平边阀座破碎率高，但更易磨损。高压匀浆法图2.4珠磨机简图二、

珠磨法生产厂商:

瑞士WAB公司德国西门子机械公司形式：立式卧式（效率高）原理：在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球和微球之间以及微球和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。产热由夹套带走。珠磨法珠磨机主体：立式和卧式圆筒型腔体一般，卧式比立式珠磨破碎效率高：因为立式机中向上流动的液体在某种程度上会使研磨珠流态化，从而降低其研磨效率。研磨珠：玻璃(密度为2.5g／cm3)或氧化锆(密度为6.0g／cm3)微球(粒径约0.1～10mm)，填充率为80％～85％。影响破碎效率的因素：转盘外缘速度细胞浓度珠粒大小及装载量温度流速珠磨法影响破碎效率的因素细胞浓度：影响悬浮液的流变特性，从而影响蛋白质的释放，一般由实验确定一般控制在40％左右，细胞湿重/体积珠磨法影响破碎效率的因素珠粒大小及装载量：过少不易破碎过多，能耗大，热扩散性能降低，引起温度升高，不利搅拌，一般控制80％～90%.珠磨法图2.7微珠直径对破碎率的影响对细菌，磨珠越小，破碎率越高；对酵母和藻类，存在最佳范围实验室：0.2mm工业：不小于0.4mm影响破碎效率的因素温度：热稳定性，目的产物不受破坏夹套冷却珠磨法影响破碎效率的因素流量：珠磨法图2.8流量对破碎速率常数的影响影响破碎效率的因素微生物类型：酵母较细菌在珠磨机中更易破碎，因为细菌细胞的大小仅为酵母细胞的十分之一，在高速珠磨机中不易破碎。珠磨法影响破碎效率的因素延长研磨时间，增加珠体装量，提高基本速度等均可提高细胞破碎率，但高破碎率，使能耗加大。同时:1、产生较多热能，增加冷却控温的难度；2、大分子目的产物失活增加3、细胞碎片较小，碎片不易分离，给后续操作带来困难。因此,破碎率控制在80％以下。珠磨法图2.5JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机三、超声波法作用机理：在超声波作用下，液体发生空化作用(cavitaton)，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。超声波法动力学方程：一级超声波法x：蛋白质释放分率t：超声波发射时间（min）k：蛋白质释放常数(min-1),取决于输入声能超声波的负面影响：1、温度上升：悬浮液预冷，夹套冷却短期冷却与短期破碎交替负载因素：声波破碎/冷却的时间比率。2、超声处理会引起诸如游离基这样的化学效应，破坏目的产物，可加入游离基清除剂（组氨酸，谷胱甘肽等）予以消除。超声波法影响破碎细胞的因素：振幅：直接与声能有关，影响比速率k粘度：影响能耗，并抑制空穴现象表面张力：表面活性剂显著影响声波破碎效率，因起泡使蛋白质变性，空穴清除悬浮液体体积：大体积需要高的声能超声波法影响破碎细胞的因素：加入珠粒体积与直径:加入细小珠粒，利于空穴形成，并有辅助“研磨效应”，提高破碎率。在相同珠粒填充密度下，随珠粒直径变化，k存在最大值。探头的材料和形状：选择具有良好声学和机械性能并对生物物质无毒的金属材料，如：钛，不锈钢等；探头的振幅与其面积呈反比，小直径探头，声能限制在较小范围内，并且效率低。细胞悬浮液的流速：流速增加，破碎率低，处理量大工业未使用，向大量悬浮液通入足够能量，很困难，产热问题。超声波法机械法破碎细胞的优缺点：优点：内含物全部释放时间短，效率高，成本低通用性强，适于实验室和工业生产缺点：需要高的能量产生高温，高剪切力，引起产品变性失活非专一性，碎片分布宽，给分离造成困难渗透压冲击法：渗透压冲击(Osmoticshock)是在各种细胞破碎法中最为温和的一种，适用于易于破碎的细咆，如动物细胞和革兰氏阴性菌。四、物理法冻融法：将细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，此冻结融化操作反复进行多次，使细胞受到破坏。冻结的作用是破坏细胞膜的琉水键结构，增加其亲水性和通透性。另一方面，出于胞内水结晶使胞内外产生溶液浓度差，在渗透压作用下引起细胞膨胀而破裂物理法2.3.2破碎方法干燥法：将细胞用不同的方法干燥（真空、冷冻、喷雾和气流等），细胞膜结合水丧失，渗透性发生变化而破裂缺点：条件变化剧烈，易引起生物物质变性物理法作用机理：酶溶法(Enzymaticlysis)利用酶反应，分解破坏细胞壁上的特殊键或某种特殊的物质，从而达到破碎细胞壁的目的。分外加酶法和自溶法两种。五、酶溶法优点：产品释放选择性高抽提速率和收率高产品破坏少pH、温度外界条件要求低不残留细胞碎片酶溶法缺点：费用高通用性差存在产品抑制不适于工业生产应用：原生质体融合释放出克隆出的胞内蛋白制取特殊的壁葡萄糖聚合物与机械法破碎细胞协同使用从细胞内不同的位置选择性的释放蛋白酶溶法

作用机理：用化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分处理方法：表面活性剂；有机溶剂；EDTA螯合剂；变性剂取决于化学试剂的类型及细胞壁、细胞膜的结构与组成。六、化学渗透法优点：产物释放有一定的选择性不需要特殊设备细胞外形保持完整，细胞碎片少，浆液粘度低，利于后续分离化学渗透法缺点：通用性差时间长，效率低某些化学试剂有毒比较项目机械法非机械法比较项目机械法非机械法破碎机理切碎细胞溶解局部壁膜效率效率高效率低碎片大小碎片细小碎片较大设备需专用设备不需专用设备内含物释放全部部分通用性强差粘度高（核酸多）低（核酸少）经济成本低成本高时间时间短时间长应用范围实验室、工业范围实验室范围表2.3机械破碎法和非机械破碎法的比较破碎技术的选择原则：目的产物在细胞质中，需机械破碎法目的产物在细胞膜附近，可采用非机械破碎法目的产物与细胞膜或细胞壁结合，可采用两种方法结合处理量的大小，细胞壁的强度和结构，目标产物对破碎条件的敏感性，破碎后固-液分离的难易程度破碎技术的研究发展方向：多种破碎方法结合与上游过程结合

1、培养过程控制

2、寄主细胞选择

3、克隆噬菌体溶解基因

4、耐高温产品的基因表达与下游结合从后分离过程考察细胞破碎技术第三节固-液分离技术

固-液分离是指将发酵液中的悬浮固体，如细胞、菌体、细胞碎片以及蛋白质等的沉淀物或它们的絮凝体分离除去。方法：过滤：利用介质过滤；重力沉降：在沉降槽中利用重力作用沉降固体颗粒；离心：分离心沉降、离心过滤；一、过滤技术最常用、最简单的固-液分离方法。（过滤速度的强化）（一）基本原理利用多孔性介质截留固-液悬浮液中的固体粒子，进行固-液分离的方法。滤浆、滤饼、滤渣、滤液。三种分类方法：按流动方向、按压力、按方式分。（二）过滤介质过滤介质也称滤材，应由惰性材料制成，既不与滤液起反应，也不吸附或很少吸附待滤液中的有效成分；耐酸、耐碱、耐热，适用于各种滤液；过滤阻力小、滤速快、反复应用易清洗；应具有足够的机械强度；价廉、易得。①滤纸。②脱脂棉。③织物介质。④烧结金属过滤介质。⑤多孔塑料过滤介质。⑥垂熔玻璃过滤介质。过滤介质的种类常用滤纸的孔径为1～7µm。适用于口服液体制剂的过滤。包括棉织品纱布、帆布等。⑦多孔陶瓷。⑧微孔滤膜。①普通漏斗。②垂熔玻璃滤器。③砂滤棒。④板框式压滤机。⑤微孔滤膜过滤器。（三）过滤装置常用玻璃漏斗和布氏漏斗，常用滤纸、长纤维和脱脂棉以及绢布等作过滤介质。⑥其它：超滤装置、钛滤器、多孔聚乙烯烧结管过滤器等。（四）常用的过滤方法1.常规过滤2.错流过滤（膜分离技术）常规过滤提高过滤速度和过滤质量是过滤操作的目标滤饼阻力是影响过滤的主要因素操作前可对悬浮液（培养液）优化过滤设备及其结构优点过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，对不同过滤特性的发酵液适应性强。缺点不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非过滤的辅助时间较长。由多个中空滤框和实心滤板交替排列在支架上组成，是一种加压下间歇操作的过滤设备。广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量1-10%的悬浮液的分离。板框式压滤机真空过滤机：真空度2.7X102～6.7X104Pa

连续操作，辅助设备多，投资大。结构：由筛板组成能转动的水平圆筒，其上有一层金属丝网，网上覆盖滤布。圆筒内沿径向被筋板分成若干个空间，每个空间以单独孔道通到圆筒颈端面的分配头上，分配头内沿径向隔离成3个室，分别与待滤液、真空、压缩空气管路相通。圆筒转速：0.5～2r/min，依次进行过滤\洗涤\吸干\吹松\卸饼等操作。过滤面积：1、5、20、40，最大50m2GP型为刮刀卸料，GP－X型为绳索卸料。混合物中悬浮颗粒的性质和大小混合液的黏度操作条件助滤剂的使用过滤分离设备和技术（王）影响过滤的因素一般情况下，悬浮颗粒越大，粒子越坚硬，大小越均匀，过滤越容易进行。流体黏度越大，过滤越困难。通常混合液的组成越复杂，浓度越高，黏度越大。（1）混合物中悬浮颗粒的性质和大小（2）混合液的黏度（3）操作条件温度升高，流体黏度降低；调整pH也可改变流体黏度。

助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，吸附胶体，扩大过滤面积，滤速增大。

常用的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、炭粒、淀粉等，其中最常用的是硅藻土。

助滤剂的使用方法有两种：一种是在过滤介质表面预涂助滤剂，另一种是直接加入发酵液，也可两种方法同时兼用。（4）助滤剂的使用助滤剂使用要点②根据过滤介质和过滤情况选择助滤剂品种①根据目的物性质选择助滤剂品种③粒度选择：实验确定④用量的确定预涂助滤剂时，间隙操作助滤剂的最小厚度为2mm；连续操作则要根据所需的过滤速率来确定。②增大过滤的表面积①选择合适的过滤介质③增加助滤剂④增加过滤推动力⑤提高温度。（5）过滤分离设备和技术为提高过滤速率和效果一般采用如下措施：二、沉降重力沉降是由地球引力作用而发生的颗粒沉降过程。根据沉降力的不同分成重力沉降式和离心沉降式两类。主要有矩形水平流动池、圆形径向流动池等。设备体积庞大、分离效率低；设备简单、能耗低。

三、离心技术〔分离较难分离物系〕在液相非均匀体系中，利用离心力来达到液液分离、液固分离、液液固分离的方法都称为～离心分离。其中液固分离分离心沉降和离心过滤。

离心分离方法（1）差速离心分离－生化工业中最常用分离方法实际物系的特点、分离目的、分离程度（目标产物和其它组分的性质及相互作用等）选择适当的操作条件（离心转数和时间）使料液的不同组分得到分级分离细胞破碎液

离心600g,10min沉降层/细胞核（4－6μm)上清液(细胞膜碎片、线粒体、溶菌体、核糖体、水溶性物质离心(10000g,10min)

沉降层（细胞膜碎片、线粒体、溶菌酶）

上清液（核糖体、水溶性物质）离心（100000g，3h)上清液(水溶性物质）沉降层（核糖体）细胞破碎液的差速离心分离（2）速率区带离心－生化研究的重要分离手段

（差速区带离心和平衡区带离心）在离心管中用某种低分子溶质（如蔗糖）调配好密度梯度（从大到小加入）在密度梯度之上加待处理的料液然后进行离心操作区带离心法可用于蛋白质、核酸等生