分离科学与进展中科大lecture2课件

色层分离法色层分离又称层析法或色谱法，它的最大特点是分离效率高，它能把各种性质极相似的物质彼此分离，而后分别加以检出和测定。色层法的发现俄国植物学家茨维特（Tswett）1906年提出色谱（Chromatography）的概念，Tswett让植物色素的石油醚萃取液流经装有碳酸钙的管柱，并继续以纯净的石油醚加以洗脱，得到三种颜色的5个色带。英国生物学家Martin和Synge于1940年提出液液分配色谱，1941年提出用气体代替液体作为流动相，他们首先提出了色谱塔板理论，以及其远见卓识的预言。1952年James和Martin因其在色谱理论和实践方面的贡献获得了诺贝尔奖。1944年出现纸层析以后，层析法不断发展，相继出现薄层层析、亲和层析、凝胶层析、气相层析、高压液相层析（HPLC）等。茨维特使用的实验装置色层分析法的种类名称分离原理吸附层析法固定相是固体吸附剂，各组份在吸附剂表面的吸附能力不同分配层析法各组份在流动相和静止液相中的分配系数不同离子交换层析法固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂亲和力不同凝胶层析法固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶中受阻滞的程度不同亲和层析法固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和无亲和力的其经组份分离柱层析吸附柱层析：根据等分离物质在固体吸附剂表面吸附能力的强弱来加以分离分析的技术分配柱层析：根据欲分离组分在两种互不混溶（或部分混溶）的溶剂间溶解度的差异来进行分离的技术吸附柱层析固液两相中处于液相中的物质在固液两相的界面发生密集现象称为吸附，利用吸附剂对不同物质具有不同吸附力使混合物得到分离的现象就叫吸附层析。在某一温度下某种组分在吸附剂表面的吸附规律可用平衡状态时此组分在两相中浓度的相对关系曲线来表示，这种关系曲线称为吸附等温线。吸附柱层析保留时间和保留体积：组分在柱上的保留特性可用保留时间和保留体积来表示。保留时间是从进样开始到流出液中出现浓度最高点的时间；保留体积是从进样开始到流出液中出现浓度最高点时流过色谱柱的流动相的体积。吸附等温线与对应的洗脱曲线常用的吸附剂及其选择氧化铝：由Al(OH)3在300~400°C时脱水制得。氧化铝因生产时条件的不同可分为中性、酸性和碱性三种，吸附能力有所不同。中性氧化铝应用较广泛，适用于醛、酮、醌、酯、内酯化合物及某些苷的分离；酸性氧化铝适用于酸性化合物，如酸性色素、某些氨基酸，以及对酸稳定的中性物质的分离；碱性氧化铝适用于分离碱性化合物如生物碱、醇以及其它中性和碱性物质。一般讲，能用酸性或碱性氧化铝分离的物质也可用中性氧化铝分离。氧化铝具有吸附能力强、分离能力强的优点。常用的吸附剂及其选择硅胶：层析用硅胶是由弹性多聚硅酸脱水制得，每批生产的硅胶，性能比较稳定。硅胶的表面化学组成有下面几种：硅胶吸附活性：活泼型>游离型>束缚型常用的吸附剂及其选择硅胶：水与硅胶表面的羟基可结合成水合硅酸：Si-OH•OH2,使其失去吸附性能。加热至100degC左右能可逆地除去这些水分，使硅胶活化。最佳的硅胶活化条件为在105~110degC加热30min。如果加热到200degC以上，硅胶将失去结构水，形成硅氧烷，使吸附能力下降，如果加热至400degC以上，硅胶将发生烧结硅胶具有微酸性，吸附能力较氧化铝稍弱，可用于分离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸、匝萜类、甾体等。常用的吸附剂及其选择聚酰胺：由已内酰胺聚合而成，因而又称聚已内酰胺或锦纶。层析用的聚酰胺为白色多孔性的非晶形粉末，易溶于浓盐酸、热甲酸、苯酚等溶剂；不溶于水及甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、苯等有机溶剂，对碱比较稳定，对酸的稳定性较差、尤其是热的酸溶液。常用的吸附剂及其选择聚酰胺：常用的吸附剂及其选择聚酰胺：一般说来，能形成氢键基团较多的溶质，其吸附能力较大；对位、间位取代基团都能形成氢键时，吸附能增大，邻位的使吸附能力减小；芳香核具有较多共轭双键时，吸附能力增大；能形成分子内氢键者，吸附能力减小。流动相及其选择流动相的洗脱作用实质上是流动相分子与被分离的溶质分子竞争占据吸附剂表面活性中心的过程。强极性的流动相分子占据吸附中心的能力强，因而具有强的洗脱作用。非极性流动相竞争占据活性中心的能力弱，洗脱作用就弱得多。常见功能团的极性强弱排序氟碳化合物<烷烃<烯烃<芳烃<有机卤化物<醚类<硝基化合物<腈<二甲胺<酯类<酮类<醛类<硫醇<胺类<酰胺<醇类<酚类<羧酸类<磺酸当有机分子的基本母核相同时，取代基团的极性增强，整个分子的极性增强；极性基团增多，整个分子的极性增强；分子中的双键多，吸附力强；共轭双键多，吸附力增强；分子中取代基团的空间排列对吸附性能也有影响，如同一母核中羟基处于能形成内氢键位置时，其吸附力将弱于不能形成内氢键的化合物常见溶剂的极性强弱排序流动相极性较弱时，可使试样中弱极性的组分洗脱下来，在层析柱中移动较快，而与极性强的组分分离。同样强极性和中等极性的流动相适用于强极性和中等极性组分的分离常用的流动相按其极性增强顺序排列如下：石汕醚<环已烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烯<苯<甲苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<吡啶<酸流动相也可以把各种溶剂按不同配比配成混合溶剂以满足分离过程对流动相的要求，流动相的选择比固定相的选择更为复杂分离条件的选择在选择层析分离条件时，必须从被分离组分、吸附剂和洗脱剂三方面来考虑。因此以上讨论是仅是一般规律，对于具体的分离应通过实验来选择适当的分离条件。聚酰胺柱层析的洗脱剂通常采用水溶液，各种不同配比的乙醇水溶液，不同配比的丙酮水溶液，稀氨水以及由DMF-醋酸-水-乙醇配成的混合溶剂溶解试样用的溶剂的极性应与流动相接近，以免因两者极性相差过大而影响层析分离分配柱层析在分配柱层析中，如果在单位时间内，一个分子在流动相中停留的时间分数（即在流动相中出现的几率）以R表示，则对于大量的分子，R则可认为是溶质分子在流动相中和固定相中的浓度比：分配柱层析中的担体（载体）严格来说，担体只起负载固定相的作用，但由于担体表面的液膜较薄，通常会出现部分担体表面裸露的现象，从而在分配作用的同时，也发生吸附作用分配柱层析分配柱层析常用的固定相为水，也可使用如稀硫酸、甲醇、甲酰胺等强极性溶剂作为固定相分配柱层析中的流动相一般是与水不相混溶的有机溶剂如正丁醇、正戊醇等。通常流动相应预先用水饱和以防止把吸附于担体上的水分带走；通常还需加入醋酸、氨水等弱酸、弱碱，以抵制抑制被分离组分离解。分配柱层析分配柱层析常用来分离强极性的、亲水性的物质如脂肪酸、多元醇、水溶性氨基酸等；如分离亲脂性的有机物，可用疏水性的有机物物作固定相，有亲水性溶剂作流动相。此时极性较强的组分易被洗脱，这与一般的层析规律相反，故称反相分配层析；分配柱层析的速度较慢，处理量小，并且温度的影响较大，因此能使用吸附柱层析分离的试样总是尽量使用吸附柱层析来分离。柱层析的操作层析柱：为一玻璃或塑料管柱，其直径/长度比通常为1:10~1:60，底部塞有玻璃纤维或脱脂棉以防止固定相流失。柱层析的操作干法装柱：将吸附剂通过漏斗缓缓加入管柱中，必要时轻敲管柱，使装填均均；装填完毕后，在吸附剂表面铺一层滤纸，打开下端活塞，从管口慢慢加入洗脱剂，吸附剂充分润湿后应注意柱内有无气泡（干法将柱易产生气泡）。湿法装柱：先在柱内加入已选定的洗脱剂，将下端旋塞稍打开，同时将吸附剂缓缓加入管柱，吸附剂一面沉淀一面添加。加入的速度不宜太快，否则会带入空气，必要时可轻轻敲击柱子使装填均匀，并可使所泡逸出。柱层析的操作层析分离（注意点）：(1)溶解样品溶剂极性应与洗脱剂相近；(2)加样时注意勿使吸附层受到扰动；(3)试样尽可能浓；(4)对于难溶于与洗脱剂极性相近的溶剂中的试样可采用干法上样；(5)展开时洗脱剂时的流速控制在0.5~2mL/min；(6)洗脱方法[分段洗脱、分别测定；分步洗脱（先弱后强）、切开样品带再洗脱]纸层析纸层析是在滤纸上进行的色层分离方法。其原理一般认为属于分配层析，其固定相为滤纸纤维中吸附的水分；由于滤纸中吸附的水分一般条件下很难脱去，因引纸层析不但可用与水不相混溶的溶剂作流动相，也可以采用丙醇、乙醇、丙酮等与水相混溶的溶剂作流动相。纸层析的分离机理除了分配作用之外，还可能存在吸附和交离子交换作用。纸层析常用纸层析装置示意图纸层析中的比移值纸层析过程中的比移值Rf：原点至斑点中心间的距离与原点至溶剂前缘间的距离之比：Rf=1/[1+KD•Vs/Vm]=a(或b)/l纸层析中的比移值Rf=1/[1+KD•Vs/Vm]=a(或b)/l不同组分因KD不同而有不同的Rf值，因此根据Rf值可进行定性鉴定进行定性鉴定时，必须用纯物质在同一滤纸上与试样并排点样，在相同的条件下进行对照层析要确定某种组分，最好用两种以下的不同展开剂展开纸层析条件的选择层析用纸的选择：均匀，无折痕，边缘整齐，纤维素松紧合适，粘度较大的展开剂如正丁醇应选较疏松的快速滤纸，粘度较小的应选较厚的慢速滤纸难分离的组分选慢速滤纸，层析方向应与纤维素方向垂直纸层析条件的选择固定相和流动相水溶性有机物如氨基酸、糖类等的分离可选以水饱和的正丁醇、正戊醇、酚类等，同时加入适量的弱酸和弱碱如乙酸、吡啶氨水以调节pH值并防止某些分离组分的离解；分离极性较小的物质如酚类时，为增加其在固定相中的溶解度，可用甲酰胺、DMF、丙二醇等的溶液预先处理滤纸，再用非极性的溶剂如氯仿、苯、环已烷、四氯化碳以及它们的混合溶剂等作展开剂；分离非极性物质如芳香油等，可采用石蜡汕、硅汕、正十一烷等为固定相，以极性溶剂如水、甲醇、乙醇等作展开剂，即反相层析。纸层析的点样和展开试样应溶于适当的溶剂中，如乙醇、氯仿、丙酮，尽量避免用水作溶剂，因斑点易扩散，且不易挥发除去液体试样可直接点样，点样可使用玻璃毛细管或微量注射器，并排点样斑点相距1.5cm左右为佳，点样处距滤纸条的一端约1.5~2cm。点样斑点在2~3mm左右为佳，如试样较稀，可等溶剂挥发后再在同一点多次点样展开可使用上升法（展开较慢）、下降法（适用于小比移值试样）、径向法、双向法（如氨基酸分离）纸层析的显色有色物质可直接观察无色物质可用各种物理或化学方法显色：紫外照射、利用显色剂（酸碱指示剂、茚三酮）、还原剂（SnCl2还原贵金属离子金铂钯铑等）薄层层析法薄层层析是在纸层析和柱层析的基础上发展起来的一种色层法。具有分离效率高、分离速度快、灵敏度高，显色方法多，应用面广等优点薄层层析法的理论基础由于毛细作用（展开剂在薄层中存在的各种粗细毛细管中流动）和展开剂蒸汽的吸附作用（改变展开剂的流速），薄层层析的理论比各种柱层析要复杂得多溶剂在薄层中的流速与展开剂的表面张力g、粘度h，以及吸附剂的种类、粒度、均匀度等因素有关，和展开距离也有关。薄层层析法的理论基础层析过程中，展开剂前缘移动的距离与时间的平方根成正比：L=(kt)1/2 其中比例常数正比于展开剂的表面张力，反比于展开剂的粘度：kg/h 展开剂前缘移动的速度：vf=dL/dt=0.5k(kt)-1/2=k/2L薄层层析法的理论基础vf=k/2L即展开剂前缘移动的速度反比于展开剂前缘移动的距离，而实际情况还要复杂得多，展开剂在薄层中的流动速度是空间、时间的复杂函数。薄层层析法的速率理论几个必要的假设：1.薄层的组成均匀；2.展开剂的组成恒定不变；3.在薄层中的任意一点在任何时候展开剂的流速恒定不变；4.展开剂的流速比展开剂的前沿移动稍慢。薄层层析法的速率理论平均塔板高度可表示为：其中Z0为液面与原点间的距离，a,b,c为三个常数，对于一定的层析系统和一定的溶质（即被分离组分），它们的值不变。样品原点与液面的距离应合适。薄层层析法的速率理论此公式包括三项，从左至右为分子扩散项，它随展开距离的增大而增大；第二项是填充项，第三项是传质项，它们均随展开距离的增加而减小。通常扩散项是主要的，当吸附剂颗粒小，展开距离较长时尤其如此因此分子扩散是塔板高度增大的主要原因。而随吸附剂颗粒的增大，后两项将成为主要的，因此要得到最佳的分离效果，合适的粒度是关键。薄层层析法的速率理论扩散项常数：b=2gDm/qdpDm是溶质分子在展开剂中的扩散系数；dp是吸附剂颗粒的平均直径；g是溶剂的表面张力；q是溶剂的速度常数。实践表明随着Rf值的降低（保留值增大），塔板高度显著增大，因此有人建议将b改为：b=2gDm/qdpRf薄层层析法的速率理论填充项常数：a=1.5A(dp5q/2Dm)1/3 式中A是随填充（涂铺）情况而定的常数，当填充情况极好时，A=1传质项常数：c=Sqdp3/2Dm S是随传质情况而定的常数值，当传质情况良好时，S=0.01C.普通薄层的超压展开D.高效薄层的超压展开薄层层析的分离度在薄层层析中层析效率同样也可用分离度Rs来表示。对于一对组分斑点，层析时它们移动的距离分别为x1，x2，两个斑点宽为w1，w2，则分离度可按如下定义：Rs=2[(x2-x1)/(w1+w2)]薄层层析的分离度经推导Rs和比移值Rf、分配系数KD、薄层的理论塔板数N’间有如下关系 可见Rf=0或1时无分离薄层层析的分离度对于一定的层析系统和被分离组分而言Rf=0.33时Rs最大，一般说来当Rf=0.15~0.75时都可以获得较好的分离效果薄层层析的吸附剂和薄层薄层层析用的吸附剂有硅胶、氧化铝、纤维素、聚酰胺等。和柱层析相似，最常用的是硅胶和氧化铝，它们的吸附能力强，可分离的试样种类多，相对于柱层析薄层层析用的吸附剂粒度更细些。吸附剂的选择与柱层析相似薄层层析的吸附剂和薄层氧化铝：铺层时不加粘合剂，直接用干粉铺层，这样的层析称为“干板”或“软板”加入煅石膏作粘合剂的氧化铝称为氧化铝G，用氧化铝G加水调成糊状，铺层并活化后使用的层析称为“硬板”。薄层层析的吸附剂和薄层氧化铝活度的测定一般把氧化铝活化成II-III级或III~IV级使用，很少使用I级（强吸附中心的存在导致斑点拖尾）薄层层析的吸附剂和薄层硅胶：机械性能较差，必须加入粘合剂铺成硬板使用，常用的粘合剂有煅石膏、聚乙烯醇、淀粉、羧甲基纤维素钠（CMC）等。不含粘合剂（用时需另加）的硅胶称为硅胶H。硅胶GF254指既含煅石膏又含荧光指示剂的硅胶；不含粘合剂只含荧光指示剂的硅胶称为硅胶HF254+366，254nm(ZnSiO4•Mn)，366nm(ZnS•CdS•Ag)薄层层析的吸附剂和薄层反相键合固定相的硅胶：薄层层析的吸附剂和薄层铺层方法：干法铺层（氧化铝干板）；湿法铺层预制薄层板，烧结板（因玻璃粉混合烧结，可经洗涤后重复使用），厚薄层板各种特制薄层混合薄层：由两种不同的吸附剂混合而成。例如要降低硅胶的活度，可以在硅胶中加入一定量的硅藻土，也有将硅胶-氧化铝混合铺层。还可以把两种吸附剂的混合配比逐渐改变，制成梯度薄层，按梯度方向展开，可使在均匀薄层在不能分离的组分得到分离各种特制薄层酸碱薄层和pH缓冲薄层：用于氨基酸或生物碱的分离等络合薄层：用AgNO3等无机试剂的水溶液代替水调硅胶煳来铺制的薄层，可用于区分不饱和程度不同的脂