高三生物一轮复习课件【知识导图+精讲专练】基因工程

勇于开始，

才能找到成功的路1.限制酶来源?在原核生物中的作用是什么？不破坏自身DNA的原因是什么？作用特点？结果？2.同尾酶概念？同尾酶切割后产生的黏性末端为何能够连接？同尾酶切割后产生的黏性末端通过DNA连接酶连接后，该序列还能再被原来的酶识别和切割吗？3.用同一种限制酶切割后，会出现哪些连接情况？用两种限制酶切割后，会出现哪些连接情况？用不同的限制酶切割的目的？4.基因表达载体的构建时选择限制酶的原则1

1.主要来源：原核生物a.限制酶在原核生物中的作用是什么？b.限制酶不破坏自身DNA的原因是什么？

2.作用特点：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。3.识别序列：4.结果：产生黏性末端或平末端

6.单酶切：容易出现反连和载体、目的基因的自连现象（即所谓环化）双酶切：不同的酶作用于不同的碱基序列，得到不同的黏性末端，避免自身环化和反向连接同尾酶：识别的靶序列不同，但是酶切后形成的粘性末端相同，可通过DNA连接酶连接，但一般不能再被原来的酶识别和切割

限制酶在原核生物中起到的作用为：切割外源DNA、使之失效，以保证自身安全DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者DNA分子被修饰（甲基化），使限制酶不能将其切开①大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，这就是回文序列。②能被限制酶特异性识别的切割部位基本都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。具有专一性121和2为同尾酶，黏性末端均为GATC，1可以切割的位点，2都可以切割。。。。必刷题P44-T4、P47-T13.1重组DNA技术的基本工具--限制酶9..用同一种限制酶切割后，会出现哪些连接情况？①目的基因—目的基因、

②目的基因自身环化、

③质粒—质粒、

④质粒自身环化、⑤目的基因—质粒、

⑥目的基因—质粒反向连接10.用两种限制酶切割后，会出现哪些连接情况？目的基因—目的基因、质粒—质粒、目的基因—质粒11.用不同的限制酶切割：可以防止目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒反向连接（或保证目的基因和质粒正确连接）7.同尾酶切割后产生的黏性末端为何能够连接？

因为同尾酶切割后产生了相同的黏性末端8.同尾酶切割后产生的黏性末端通过DNA连接酶连接后，该序列还能再被原来的酶识别和切割吗？不一定1.DNA连接酶的作用？类型及特点？2.载体的种类？各自的用途？作为载体必备的条件？质粒的概念？3.DNA的粗提取与鉴定实验原理？过滤的方法？过滤后取上清液还是取沉淀物？析出的操作步骤？2

二、DNA连接酶1.作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。2.分类：E.coliDNA连接酶：来源于大肠杆菌；只能连接具有互补黏性末端的DNA片段

T4DNA连接酶：来源于T4噬菌体；既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，又能连接双链

DNA片段的平末端（但连接平末端的效率较低）三、载体1.载体的种类：质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒

2.载体的作用：将目的基因送入受体细胞3.质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的的双链环状DNA分子4.作为载体必须具备的条件：①能在受体细胞中自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制②具有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（目的基因）插入。③具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选④对受体细胞无害。5.真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行人工改造的。3.1重组DNA技术的基本工具1.基因工程的基本操作程序？基因工程操作环境？操作水平？原理？2.目的基因的筛选与获取方法？3.逆转录法的过程？4.基因组文库与cDNA文库的区别（3

1.基因工程的基本操作程序？P76四步2.基因工程操作环境：体外；操作水平：DNA分子水平；原理：基因重组；3.不同生物DNA能够拼接的原理：不同生物的DNA都是由脱氧核苷酸组成的，都是双螺旋结构或（不同生物的DNA具有共同的空间结构和基本单位）4.目的基因在受体细胞中表达出相同蛋白质的原理：①基因是控制生物性状的基本单位。②遗传信息的传递都遵循中心法则。③生物界共用一套遗传密码。5.Bt基因（Bt抗虫蛋白基因）表达出的Bt抗虫蛋白：P77右上角杀死害虫的原理？Bt抗虫蛋白被分解为多肽，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，造成害虫死亡。

不会对人畜有害的原理？①Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人畜的胃液呈酸性②人畜的肠道细胞没有特异性受体。一、目的基因的筛选与获取1.何为目的基因？P76用于改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因，主要指编码蛋白质的基因2.目的基因的获取方法：人工合成、从基因文库中获取、PCR获取和扩增3.cDNA文库是由mRNA逆转录形成的，只包含真核细胞基因结构中外显子的序列，可在不同物种之间交流；3.2基因工程的基本操作程序2编码区2.基因文库构建方法：直接分离法、反转录法1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA1.反转录法1.PCR原理？条件？缓冲溶液中添加Mg2+的作用？过程？鉴定PCR产物的方法？用PCR可以扩增mRNA吗？2.引物的作用？要求？为何需要2种引物？扩增n次需要多少个引物？4

5.PCR：名称：聚合酶链式反应

原理：DNA半保留复制

仪器：PCR扩增仪（PCR仪）条件：①模板：DNA母链

②原料：4种脱氧核苷酸③酶：耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）④引物

⑤缓冲溶液（含Mg2+）缓冲溶液中添加Mg2+的作用？真核细胞和细菌的DNA聚合酶需要Mg2+激活。过程：①变性：温度上升到至90℃以上时，双链DNA解聚为单链

②复性：温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合

③延伸：温度上升到72℃左右时，4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补

配对原则加到引物的3’端，合成新的DNA链。引物的作用：与两条模板链结合，使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸引物的种类：需2种引物。为何需要2种引物？DNA的两条反向平行链都做模板，其碱基序列不同，且DNA聚合酶只能从3’端延伸子链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增扩增n次需要多少个引物？至少需经过3次循环才能分离得到所需要的DNA区段鉴定PCR产物的方法琼脂糖凝胶电泳用PCR可以扩增mRNA吗？不可以，需要逆转录成cDNA再进行扩增3①引物自身不能环化②两种引物之间不能互补配对③引物长度不宜过短，防止引物随机结合两种引物的要求当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时：1.若无法获得该蛋白，原因可能是什么？2.以上情况如何解决？3.若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？4.以上情况如何解决？5.若原核生物由mRNA逆转录形成的cDNA与原基因的结构相比有哪些不同？6.若真核生物由mRNA逆转录形成的cDNA与原基因的结构相比有哪些不同？5

思考：当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时：1.若无法获得该蛋白，原因可能是什么？2.以上情况如何解决？3.若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？4.以上情况如何解决？真核生物的基因有内含子，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，因此无法表达出该蛋白使用cDNA作为目的基因或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞原核生物缺少高尔基体和内质网等细胞器，无法对真核生物的蛋白质进行正确的加工人工体外再加工或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的________和具有调控作用的________区组成的连续不连续编码区非编码若原核生物由mRNA逆转录形成的cDNA与原基因的结构相比有哪些不同？缺少启动子和终止子若真核生物由mRNA逆转录形成的cDNA与原基因的结构相比有哪些不同？缺少启动子、终止子、内含子相似名词比较比较项目位置功能启动子（其上有一个重要的位点：RNA聚合酶结合位点）起始密码子终止子终止密码子DNAmRNADNAmRNA终止翻译驱动翻译终止转录驱动转录1.启动子≠起始密码；终止子≠终止密码，密码子是mRNA上的，参与翻译过程2.生物体内所有细胞（除哺乳动物成熟红细胞外）均具有相同的基因，但是有的基因在所有细胞中都表达（如呼吸酶基因），但是有的基因只在特定细胞中选择性表达（如胰岛素基因在所有体细胞中均存在，所以所有细胞中的DNA均可与胰岛素基因探针形成杂交带。但是其仅在胰岛B细胞中表达，所以只在胰岛B细胞中能转录出相应的mRNA，因此只有胰岛B细胞中的mRNA与胰岛素基因探针形成杂交带。）1.基因表达载体的构建目的？2.基因表达载体组成？3.基因表达载体各组成部分的作用？4.转化的概念？5.将目的基因导入受体细胞的方法及适用范围？6

第二步——基因表达载体的构建（核心）801.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时能够表达和发挥作用。2.组成：目的基因

＋

启动子

＋

终止子

＋

标记基因

+复制原点（1）标记基因：便于重组DNA分子的筛选（2）启动子：DNA片段，基因上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA

（诱导型启动子----激活或抑制基因的表达）（3）终止子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的下游，转录终止的信号（4）复制原点：DNA复制开始的地方3.构建过程：需要限制酶和DNA连接酶的参与载体与基因表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。基因表达载体在载体基础上增加了启动子、目的基因、终止子

选择限制酶的原则：①选目的基因两端和载体都有限制酶的切割位点；可用同种限制酶或者产生相同末端的限制酶（同尾酶），同时切割载体和含有目的基因的DNA片段，②所选酶切位点不能破坏目的基因、标记基因（至少有一个完整）、复制原点、启动子、终止子③为避免目的基因和质粒的自身环化及目的基因与质粒的反向连接，可使用两种切割后能产生不同黏性末端的限制酶来切割目的基因和质粒，确保目的基因和质粒正向连接。目的基因应插入启动子和终止子之间。1.在培养有些转基因植物时，常用农杆菌转化法，农杆菌的作用是什么？2.原理？3.采用农杆菌转化法导入目的基因时，为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上?4.目的基因插入染色体DNA上的目的是什么？5.两次拼接、两次导入6.转基因的植物细胞如何获得最终的新品种？7

三、将目的基因导入受体细胞1.转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程2.农杆菌转化法：受体细胞：受精卵Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性这种细胞称为感受态细胞思考：1.在培养有些转基因植物时，常用农杆菌转化法，

农杆菌的作用是什么？2.原理？3.采用农杆菌转化法导入目的基因时，

为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上?4.目的基因插入染色体DNA上的目的是什么？5.两次拼接、两次导入6.转基因的植物细胞如何获得最终的新品种？植物组织培养农杆菌能侵染双子叶植物和裸子植物，将目的基因转入到受体细胞中原理:农杆菌Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，因此只要将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。P81由于Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入到了T-DNA上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上转化的目的：使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达植物组织培养1、检测与鉴定目的基因的目的：2、检测与鉴定的方法：3、PCR技术检测基本原理？4、核酸分子杂交技术原理？8

1.分子水平检测2.个体生物学水平鉴定一、检测与鉴定的目的：二、检测与鉴定的方法：①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质方法：PCR技术

核酸分子杂交方法：PCR技术

核酸分子杂交目的基因的检测与鉴定检测和鉴定目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。①抗虫棉：采摘抗虫棉叶片饲喂棉铃虫②耐盐水稻：用一定浓度的盐水浇灌水稻③抗除草剂植物：喷洒除草剂④抗病毒（菌）植物：病毒（菌）接种实验⑤转基因产品：提取转基因产品与天然产品的功能进行活性比较原理：抗原抗体特异性结合具体操作：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已翻译是否具有抗性及抗性程度抗原-抗体杂交注意对照原则：对照组为非转基因植物;

实验组为转基因植物，其他条件一致PCR技术检测基本原理：根据目的基因特点设计特定引物，然后进行PCR，看是否扩增出目的基因。①若有扩增产物,表明转入目的基因

②若没有,表明没有成功转入目的基因特别说明：mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA在进行扩增核酸分子杂交技术①用放射性同位素标记（或荧光标记）的目的基因作探针与受体细胞的染色体DNA进行杂交，如果显示出杂交带，表明目的基因已插入染色体DNA中②用放射性同位素标记（或荧光标记）的目的基因作探针与受体细胞的mRNA杂交，如果显示出杂交带，表明目的基因已转录121.蛋白质工程基本思路？2.确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？3.蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要原因？4.为什么蛋白质工程改造基因而不是直接改造蛋白质？5.降低人对小鼠单抗了抗体的免疫反应的思路：1.概念：蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。

2.地位：

蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程3.崛起的缘由：基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要P934.目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造P945.为什么直接操作对象是基因？①基因决定蛋白质；②改造基因可以遗传，且可产生大量蛋白质6.基本思路P94：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需蛋白质7.确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？P94讨论2确定目的基因的碱基序列后，可以人工合成目的基因，或应用基因定点突变技术来进行碱基的替换、增添等进而改造基因8.蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要原因？P95最后难度很大，主要是因为蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构十分复杂3.4蛋白质工程P93—95①基础:蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系②操作方法及操作对象:改造或合成基因

③结果改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，满足人类生产和生活的需求操作水平：DNA分子水平9.为什么蛋白质工程改造基因而不是直接改造蛋白质？10.降低人对小鼠单抗了抗体的免疫反应的思路：①蛋白质的高级结构十分复杂，直接改造难度大②蛋白质是由基因编码的，改造了基因可以间接改造蛋白质③基因可以遗传，蛋白质无法遗传项目蛋白质工程基因工程操作对象操作起点操作水平操作流程结果实质联系基因基因DNA分子水平DNA分子水平预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新基因→获得所需要的蛋白质目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定可生产自然界没有的蛋白质可生产自然界已有的蛋白质通过改造或合成基因来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程；②蛋白质工程离不开基因工程，其包含基因工程基本操作；预期蛋白质功能目的基因蛋白质工程与基因工程的比较3.3基因工程的应用P87--91本页不用背，了解即可1.乳腺生物反应器制备流程？2.为什么将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起？3.药用蛋白基因存在于转基因动物的哪些细胞中？4.生物反应器除了用乳腺，还可以用什么器官？5.膀胱生物反应器哪些方面优于乳腺生物反应器？6.研制膀胱生物反应器时，应如何处理目的基因**？7.用生物反应器生产药物的优点？8.转基因技术中会形成新物种吗？9.乳腺生物反应器经过有性生殖产生的后代一定可以产生目标蛋白吗？9

与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起应用3：转基因哺乳动物批量生产药物：乳腺生物反应器或乳房生物反应器1.为什么要将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起？

让药用蛋白基因只在乳腺细胞中特异性表达2.利用乳腺生物反应器生产蛋白质，有什么局限性？受性别和发育时期的限制3.如何改进？

将目的基因与膀胱上皮细胞中特异表达的基因的启动子重组，

制备膀胱生物反应器，从尿液中提取4.乳腺生物反应器指整个转基因动物，而不是转基因动物的乳腺5.乳腺生物反应器经有性生殖产生的后代一定可以产生目标蛋白吗？不一定；①目的基因在受体细胞中不是成对存在的，相当于杂合子，配子中可能不含该基因，则有性生殖产生的后代中可能不含目的基因②有性生殖产生的后代可能为雄性，不能分泌乳汁泌乳期早期胚胎培养胚胎移植胚胎移植前，应取样滋养层，做DNA分析，鉴定性别，保留雌性★

转基因技术中会形成新物种吗？不会，转基因技术一般不会导致生殖隔离1.乳腺（房）生物反应器与基因工程菌生产药物2.为什么可以用猪的器官解决人类器官移植的来源问题？3.利用转基因技术对猪的器官进行改造，培育不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官，采用什么方法？4.相比从天然产物中提取的酶，构建基因工程菌，然后用发酵技术生产酶，优势？10

比较项目乳腺（房）生物反应器基因工程菌生产药物基因结构基因产物受体细胞导入方式生产条件产物提取哺乳动物基因的结构与人类结构基本相同细菌或酵母菌等生物的基因结构与人类基因结构有较大差异与天然蛋白质完全相同细菌细胞内缺少内质网、高尔基体等细胞器，合成的蛋白质可能不具有生物活性哺乳动物的受精卵微生物细胞显微注射法Ca2+处理法（感受态细胞法）不需要严格的灭菌，温度等外界条件对其影响不大需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件从动物乳汁中提取，相对简单（一般经过工业发酵后）从微生物细胞（或发酵液）中提取，相对复杂乳腺（房）生物反应器与基因工程菌生产药物应用4：培育不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官1.为什么可以用猪的器官解决人类器官移植的来源问题？①猪的内脏构造、大小、血管分布与人的极为相似②与灵长类动物相比，猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒要少得多2.利用转基因技术对猪的器官进行改造，培育不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官，采用什么方法？①在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达②设法除去抗原决定基因然后再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。其他应用1.相比从天然产物中提取的酶，构建基因工程菌，然后用发酵技术生产酶，优势？P91最后一段纯度更高、生产成本显著降低、生产效率较高。2.用基因工程培育可以降解多种污染物的超级细菌，处理环境污染。★1.工程菌概念2.用大肠杆菌生产人胰岛素的流程：3.目前除了可以利用大肠杆菌生产人胰岛素，还可以用酵母菌来生产人胰岛素，请从细胞的结构与功能相适应的角度考虑，二者生产的人胰岛素有何不同？4.蛋白质工程概念？地位？崛起的缘由/11

应用2：用基因工程菌生产药物：（如细胞因子、抗体、疫苗、激素等）1.工程菌：2.用大肠杆菌生产人胰岛素的流程：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类称为基因工程菌P91①人胰岛素基因的筛选和获取：用RT-PCR（逆转录PCR）获取人胰岛素基因（cDNA）②人胰岛素基因表达载体的建构：用限制酶和DNA连接酶将人胰岛素基因（要添加启动子、终止子）与质粒拼接，构建基因表达载体；③将人胰岛素基因导入大肠杆菌细胞：用Ca+处理大肠杆菌，将重组质粒导入大肠杆菌；④人胰岛素基因的检测与鉴定：检测筛选出成功转化的大肠杆菌⑤进行发酵培养（菌种扩大培养、配置培养基、灭菌、接种、发酵、产物的分离和提纯）思考：目前除了可以利用大肠杆菌生产人胰岛素，还可以用酵母菌来生产人胰