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文档简介

人体血红蛋白和血型的测定

实验(七)前言

血红蛋白是红细胞的主要成分,除作为血液缓冲物质而发挥作用外,其功能是在肺部结合氧气,送到全身各组织并将组织中的二氧化碳送到肺部而呼出体外。

血红蛋白分子是一种由亚铁血红素和珠蛋白结合而成的结合蛋白,由四个亚基构成,分别为两个α亚基和两个β亚基。血红蛋白的贮氧、运氧功能都是依靠血红素中的Fe2+与O2的配位结合,血红蛋白与氧结合是以协同效应方式进行的。

除了运载氧与二氧化碳,血红蛋白还可以一氧化碳、氰离子结合,结合的方式也与氧完全一样,所不同的只是结合的牢固程度,一氧化碳、氰离子一旦和血红蛋白结合就很难离开,这就是煤气中毒和氰化物中毒的原理。

实验目的1.掌握722分光光度计的原理及操作方法;2.了解比色法测定的原理;3.掌握氰化高铁血红蛋白法的原理;4.熟悉移液管的使用及末梢采血的方法;5.掌握血红蛋白指标测定的意义及在运动实践中的应用。722分光光度计的原理

光是一种电磁波,白光是由不同波长(400~760nm)的电磁波按一定比例组成的混合光,通过棱镜可分解成红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种颜色相连续的可见光谱。在白光的照射下,物体所以呈现特定的颜色,是因为物体对不同波长的光有选择性地吸收所致。不同物质由于其分子结构不同,对不同波长的光线的吸收能力也不同,因此,每种物质都具有其特异的吸收光谱。

T=I/I0

其中:T

透过率

I0

入射光强度

I

透射光强度

A

吸光度

K

吸收系数

L

溶液的光径长度

C

溶液的浓度分光光度分析技术的原理

绿黄青

橙白青蓝红蓝紫

上图对应的两边互为互补光,如将互补的色光相混即产生白光。

1.分光光度法是利用物质特有的吸收光谱来鉴定物质及其含量的方法。

2.光投射到物体上可被物体吸收或反射,如该物体是透明的则还有部分光可以透过。在白光照射下,物体所呈现特定的颜色,就是物体对不同波长的光有选择性的吸收所致。而溶液对某些波长的光的吸收极少而对其他波长的光吸收较多,则溶液就呈现这种吸收较少且透过较多光的颜色(如:硫酸铜溶液对黄光吸收最强,对蓝光吸收最弱,故在白光的照射下该溶液呈现____)

,说明任何有色溶液(或物体)都只对一种单色光有强烈的吸收能力,而对其它波长的光吸收能力较弱。

(一)人体血红蛋白的测定

实验原理

Hb被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白(Hi),Hi与氰离子结合成氰化高铁血红蛋白(HiCN),它在540nm有一吸收峰,测其光密度而得Hb的浓度。

Hb+K3Fe(CN)б

氧化

Hi

Hi+CN

合成HiCN

实验试剂和仪器

试剂:

(1)HiCN稀释液(有毒)

(注:高铁氰化钾法测定血红蛋白比较准确、稳定,是目前国家承认的标准,但试剂中有氰化物,剧毒,在实验进行过程中避免污染,实验完毕后注意药品的处理,不能乱倒)

(2)75%的酒精

仪器:

722分光光度计、半自动生化分析仪、一次性采血装置、一次性采血管(20微升)、消毒棉球、5毫升试管、移液管

测定管(一次性试管)氰化高铁血红蛋白稀释液5ml酒精消毒手指,并采取新鲜血液20µl

混匀后放置至少10分钟540nm比色,空白调零读取测定管光密度值实验操作步骤

1

2

3

4

5

6

7

8

1光源2聚光透镜3色散棱镜4狭缝

5比色杯6光门7光电管8检流计722分光光度计结构示意图

722分光光度计的使用(1)开启电源,指示灯亮,仪器预热20分钟,选择开关置于“T”档(2)旋动波长手轮,将测试所需540nm波长调节至刻度线处。(3)打开样品室盖,调节“0%T”旋钮,使数字显示为“0.00”。(4)以稀释液(不含待测物质的反应液)作为空白,盖上样品室盖,调节透过率“100%T”旋钮,使数字显示为“100.0”,然后将选择开关置于“A”档,用稀释液调消光零。(5)移入待测溶液,显示值即为样品的吸光度A值。电源开关选择开关722型分光光度计波长手轮0%T”旋钮100%T”旋钮比色杯(皿)样品室采血时,采血针应一人一针,严防交叉感染。第一滴血弃去不用(为什么?)3.毛细吸管吸血时,避免气泡吸入。否则会使测定结果偏低。若有气泡产生,请使用干棉签吸之。4.采血时,动作应迅速,否则易发生凝血现象。5.

配制好的HiCN稀释液中因氰化钾含量低,毒性不是很大,但仍应妥善保管。测定后的废液不能与酸性溶液混合,因为氰化钾遇酸可产生剧毒的氰氢酸气体。为防止氰化钾污染环境,比色测定后的废液集中于广口瓶中,可用除毒液除毒。

[注意事项]

Hb在运动实践中的应用:

Hb指标主要用于评定某个训练周期或阶段,如根据1-2周时间内运动员对运动量和运动强度的反应来评定运动员的机能状态等。Hb在运动训练中的变化是多因素综合作用的结果,如仅从运动负荷的影响看,大运动量训练期间系统测试血红蛋白,可能会出现以下三种类型:

(1)训练初Hb下降,经一段训练后,Hb又逐步回升。

(2)训练初Hb下降,经一段训练后,始终未出现回升。

(3)训练期间,

Hb无显著变化。

(1)表示运动量安排适宜;(2)、(3)则分别由于运动量过大,过小而未能出现血红蛋白的正常变化趋势。因此,测试Hb的含量,对于评定运动员的机能状态和运动训练水平等具有重要的意义。

(二)ABO血型的鉴定

血型的概念:是指血细胞上特异凝集原的类型。

ABO血型的分类依据血型红细胞上的凝集原血清中的凝集素AA抗BBB抗AABA、B无O无抗A、抗B备注:红细胞表面上含凝集原,血清中含凝集素(一)实验目的原理:

通过用标准血型抗体对红细胞膜上ABO系统血型抗原的鉴定,掌握ABO系统定型的基本操作方法,判读技能。

根据lgM类特异性血型抗体与红细胞上特异性抗原结合能够出现凝集反应的原理。

即:凝集原与其相对应的凝集素相遇时将会发生凝集反应

例如:凝集原A+抗A凝集反应(二)实验器材:采血器具、玻片、玻棒、抗A抗B血型定型试剂(三)实验步骤:(玻片法)1.在白纸上分别注明“抗A”“抗B”字样,并放上玻片,分别滴1~2滴血型定型剂;2

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