遗传性疾病的试验诊断

遗传性疾病的试验诊断遗传性疾病的分类

染色体病：在生殖细胞发生和受精卵早期发育过程中发生差错，产生整条染色体或染色体节段超过或少于二倍体数，表现出先天发育异常单基因病：起因于致病基因，在一对同源染色体上可能其中一条带有突变基因，也可能同源染色体上的对应位点都是突变基因。有特征性家系传递格局遗传性疾病的分类多基因病：亦称多因子病，起因于遗传素质和环境因素，包括一些先天性发育异常和常见病线粒体遗传病：线粒体基因突变可导致线粒体遗传病，随线粒体传递，呈细胞质遗传体细胞遗传病：癌肿起因于体细胞遗传物质的突变，可表现出家族性癌肿遗传易感性。有些先天畸形亦属此类。单基因遗传病的分类常染色体连锁遗传性疾病：致病基因位于常染色体性染色体连锁遗传性疾病：致病基因位于性染色体常染色体连锁遗传性疾病常染色体连锁隐性遗传位于一对常染色体上的两个等位基因均发生突变才能产生临床症状，此时所导致的相应疾病称为常染色体连锁隐性遗传性疾病同一对染色体中只有一个等位基因发生突变的个体称为杂合子，二个等位基因均发生突变的个体称为纯合子囊性纤维变：常染色体连锁隐性遗传(7q31)常染色体连锁遗传性疾病常染色体连锁显性遗传位于一对常染色体上的二个等位基因之一发生突变即产生临床症状，所导致的相应疾病称为常染色体连锁显性遗传性疾病特点：家系中患者数目较多，大多情况下每一代均有患者Huntington舞蹈症：常染色体显性遗传(4p16.3)性染色体连锁遗传性疾病X染色体连锁遗传大多为隐性遗传(如甲型血友病、杜氏肌营养不良症)显性遗传非常罕见Y染色体连锁遗传产前筛查（诊断）在胎儿出生前对其出生缺陷（包括先天异常和宫内感染）进行检查产前筛查包括实验室检测、影像学检查等围产医学产前筛查的实验室检测染色体病的实验室筛查胎儿宫内感染的实验室检测遗传性疾病的基因检测染色体病的实验室筛查孕早期筛查（孕7～11周）孕中期筛查（孕15～20周）产前筛查只是对胎儿罹患某一先天性或遗传性疾病的风险评估而非确诊中国出生缺陷现状中国每年约有100万缺陷儿出生，其中只有30%可以治愈或纠正全国累计近3000万个家庭曾生育过出生缺陷和先天残疾儿，占全国家庭总数1/10中国每年出生约3-5万唐氏儿，10万神经管缺陷患儿造成沉重的社会负担和精神压力此项支出每年达到300亿每个唐氏患儿仅医药费支出就达25万1个患儿平均累及7个成人关键在于预防三级预防可大幅度减少出生缺陷儿的发生1级：孕前保健2级：孕期保健(产前筛查与诊断)3级：新生儿筛查(早发现早干预)筛查指征危害严重发病率较高，人群分布明确筛查阳性有进一步明确诊断方法筛查方法较简易筛查费用明显低于治疗费用孕期保健筛查的主要疾病21-三体综合症，发病率为1/700~1/80018-三体综合症，发病率1/6000~1/8000开放性神经管缺陷，发病率1/1000~1/2000新生儿筛查的主要疾病先天性甲状腺功能低下苯丙酮尿症先天性肾上腺皮质增生症葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏采集一滴新生儿足跟末梢静脉血于滤纸上，干燥后运输至筛查中心统一检测。血清学筛查的基本概念安全性抽取孕妇2ml静脉血，通过测定血清中的特定标志物，间接地判断胎儿患遗传缺陷疾病的风险度非创伤性筛查对象原则上为孕9-20+6周的所有孕妇血清学筛查的基本概念孕妇自愿孕妇接受产前筛查遵循自愿原则，明确产前筛查的内容、意义和相应风险，并签署产血清学前筛查知情同意书筛查与确诊筛查(高危)病例，需进一步做绒毛膜(孕早期)或羊水穿刺(孕中期)做染色体核型分析进行确诊。

年龄曾是唐氏综合征产前筛查的指标

产前筛查的血清标志物1984年首次报道怀有染色体异常特别是DS胎儿的孕妇血清AFP水平偏低，建议将AFP作为35岁以下孕妇胎儿染色体异常的筛查指标1987年报道怀有DS胎儿的母血中人绒毛膜促性腺激素（HCG）的水平是正常孕妇的2倍；非结合雌三醇（uE3）的水平比正常低25%，提示可以作为另两个筛查指标1991年报道妊娠相关血浆蛋白A（PAPP-A）与DS有关1996年，抑制素A(inhibinA)成为第四个血清检测指标以上单个指标进行唐氏综合征的筛查，检出率均太低(30%左右)将AFP、HCG、uE3和InhibinA四项指标联合检测称为四联筛查对14-20周的孕妇进行筛查，检出率为81%，假阳性率约5%目前国内孕中期血清学产前筛查模式(Second-trimester

maternalserumscreening)

AFP+freeβHCG/HCGAFP+freeβHCG/HCG+uE3AFP+freeβHCG/HCG+uE3+InhA全球筛查模式模式孕周项目优势缺点孕早期联合筛查(1stTrimesterCombined)9~13＋6NT+PAPP-A+fβhCG/βhCG时间早：筛查在14周前结束具有超声影像支持尽可能早做出决策得到证实的检出率：90％DR/5%FPR(1TCombined)必须具备开展NT的条件和技术25％孕妇错过了早期筛查时间,中国尤甚必须具备CVS的条件和技术孕中期筛查(2ndTrimester)14-20+64联：AFP，hCG(Total或Free)，uE3，Inhibin-A已得到广泛应用，成熟模式所有孕妇都可以进行中期筛查检出率高:81%DR/5%FPR决策时间晚无超声监测终止妊娠不够安全血清学整合筛查(Serumintegrated)(孕早期不出报告)9~13＋6&14-20+6孕早期：PAPP-A孕中期：4联仅生化测试，简单易行无需NT，DR/FPR与孕早期筛查类似可据此建立孕早期筛查项目检出率高:86%DR/5%FPR决策时间晚无超声监测不能提供完整的孕早期数据整合筛查(Integrated)(孕早期不出报告)9~13＋6&14-20+6孕早期：NT&PAPP-A孕中期：4联降低FPR(2%)/90%DR－减少羊水穿刺率建立孕早期筛查项目决策时间晚保留风险较高的结果,如NT>3mm终止妊娠不够安全不能提供完整的孕早期数据序贯筛查(Stepwisesequential)(仅高危病例在孕早期出报告)9~13＋6&14-20+6孕早期：NT+PAPP-A+fβhCG/βhCG孕中期：4联建立孕早期筛查项目早期高风险结果进行诊断性检查同样的DR(90%)，FPR降低(3.7%)只有很少部分(1%)孕妇在孕早期结束筛查终止妊娠时间晚，不安全遗传咨询难度高酌情筛查(Contingent)(仅灰色区域风险孕妇进行孕中期筛查)9~13＋6&14-20+6孕早期：NT+PAPP-A+fβhCG/βhCG孕中期：4联可建立完整的孕早期筛查项目80％以上孕妇在孕早期结束筛查对高危组，中间组和低危组的界定可能导致中间组孕妇焦虑：须等待4周我国开展筛查的现状及可选方案我国开展现状：对孕早期筛查的重要意义认识不足，孕中期筛查仍为主流孕早期筛查技术不成熟，尤其规范NT检测有相当难度大多数孕妇孕中期才参加产前保健大多数中心仅限于传统的中期两项筛查产筛质量管理意识有待加强针对我国国情推荐参考方案：积极宣传孕早期筛查的重要意义，产筛未来发展趋势在不具备规范NT检测情况下，建议进行孕中期四联筛查，使其成为国内产筛的基础性工作有条件的地区开展酌情、序贯或血清整合等多种模式筛查，为孕妇提供更多选择胎儿宫内感染的实验室检查TORCH综合征的孕前和产前检测TORCH综合征是病原微生物感染引起胎儿异常的一组疾病弓形虫（toxoplasma,TOXO）风疹病毒（rubellavirus,RV）巨细胞病毒（humancytomegalovirus,CMV）单纯疱疹病毒（herpessimplevirus,HSV）其他病原微生物（other,O）孕妇为易感人群，感染途径与一般人相同可发生在妊娠各期，宫内感染可造成严重后果感染后除免疫缺陷者外，机体均产生特异性抗体。采集孕妇外周血检测相关病原体的特异性抗体IgG和IgM，以判断孕妇是否曾经或正在感染某一病原体抗体检测：免疫学方法血清学检测的局限性抗体产生时间判断胎儿感染须谨慎孕前筛查更为重要免疫缺陷者可能检测不到相应抗体单基因遗传病的基因诊断单基因遗传病中常见的分子异常遗传性疾病的产生是由于一个（或数个）基因发生异常导致这些基因所载有的遗传信息受到改变，而发病是通过遗传物质的表达产物——蛋白质（或酶）的表现异常所致。基因突变主要包括点突变、片段性突变和动态性突变。点突变(pointmutation)包括错义突变、无义突变、移码突变各种点突变所造成的后果：蛋白质分子量改变蛋白质合成量下降无蛋白质合成片段性突变(fragememtalmutation)核苷酸的丢失和增多缺失：基因中硷基（遗传物质）的丢失插入：外来基因片段插入某一基因序列中倍增：基因内部某一段序列发生重复基因重排：基因组中原来不在一起的基因由于某些原因重新排列动态性突变(dynamicmutation)

以三核苷酸为单位的重复序列在传递过程中不稳定，会发生扩展，即子代的重复次数往往较亲代大为增加，因此又称动态性突变。脆性X综合征：CGG重复少年脊髓型共济失调：GAA重复亨廷顿病：CAG重复X染色体（）的脆性位点脆性X综合征是遗传性智力缺陷最常见的一种。致病基因FMR-1的5’端有CGG三核苷酸重复区。普通男性群体中的患病率为1/4000。普通女性群体中的患病率为1/6000。患者智力低下、语言障碍、行为异常、呈特殊面容。正常个体：CGG重复次数6~52次，中国人群以(CGG)28为多见。前突变(premutation)：(CGG)

53~230为携带者，虽表型正常，但在传递过程中易发生进一步扩展，使后代的CGG重复次数大大增加，并有异常表型。全突变：(CGG)≥230时，100%的男性表现为典型的脆性X综合征,53%的女性表现为程度不同的智力低下。遗传性疾病基因诊断的策略（一）直接诊断策略

基因诊断的直接策略是通过各种分子生物学技术检测基因的遗传缺陷，因此直接诊断的前提是被检测基因的正常序列和结构必须被阐明。直接诊断由于是直接揭示遗传缺陷，因而比较可靠。

直接诊断常用技术Southern印迹技术将基因组DNA用限制性内切酶水解，经凝胶电泳分离用碱处理使凝胶中的DNA变性为单链，转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上用标记的特异性探针与变性单链杂交，可使特异条带显影实验结果为限制性长度片段多态性分析（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）直接诊断常用技术聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）在突变点二侧设计引物，经扩增后可得含有突变点的扩增产物以突变筛查技术找出突变点SSCP、DGGEMeltingcurveanalysisDNAsequencing

DMD的基因检测Duchennemusculardystrophy(DMD)是一种高发病率、高致残、高致死的X连锁的遗传性疾病，平均每3500个活产男婴中即有一个患者DMD基因的全长为250kb，有79个外显子DMD的最主要遗传缺陷是外显子缺失，约占突变的60%~70%用多重PCR技术对外显子进行筛查DMD基因外显子的检测（二）间接诊断策略

间接诊断是在家系中进行连锁分析，通过分析可确定个体来自双亲的同源染色体中的哪一条为致病染色体（与致病基因连锁），从而判断该个体是否带有致病基因间接诊断不是寻找DNA的遗传缺陷，而是通过分析DNA的遗传标志的多态性估计被检者患病的可能性遗传标志及其多态性单拷贝序列在基因组中仅出现一次或少数几次，大多数基因(50%~80%)在单倍体中都为单拷贝重复序列真核生物染色体DNA中存在许多不同程度的重复序列，按照孟德尔遗传定律传递大多存在于基因的非编码区根据DNA序列重复出现频率的不同而分为不同类型中度重复序列短分散片段(shortinterspersedsegments,SINEs)平均长度300bp，拷贝数可达10万左右长分散片段(longinterspersedsegments,LINEs)平均长度3500~5000bp，拷贝数达1万左右在人类基因组中约占12%中度重复序列大多数不编码蛋白质,与单拷贝基因间隔排列有些是编码蛋白质或RNA的结构基因（HLA、rRNA、tRNA、组蛋白、免疫球蛋白基因）可存在于结构基因之间、基因簇之中、内含子内部高度重复序列存在于基因组的间隔区和基因的内含子等非编码区重复频率可高达106以上，不转录具高度多态性，成为有效的遗传标志，已广泛用于基因定位和基因诊断小卫星序列也称数量可变的串联重复序列(VariableNumberofTandemRepeat,VNTR)以6-70bp为单位，可重复数次至数十次，以串联形式排列微卫星序列(microsatellite)又称短串联重复序列(STR)以2-6bp为单位，重复次数可达几十次在基因组中出现的数目和频率不同，分布广泛，具高度多态性

碱基组成不同于其他部分，用密度梯度离心可将其与主体DNA分开重复序列的检测PCR技术在重复序列二侧设定引物，经PCR扩增用凝胶电泳分离扩增产物根据产物片段大小即可决定重复序列的重复次数遗传咨询和产前基因诊断遗传咨询明确诊断先证者，确定引起疾病的分子异常了解本病传递至下代的风险率判断胎儿是否患病遗传咨询和产前基因诊断产前基因诊断羊水细胞（16~20周）绒毛膜细胞（8~12周）非创伤性取样母体外周血中胎儿游离DNA遗传咨询战略路线（以DMD为例）MD是否由Dystrophin缺陷所致?是。孕妇是否携带者？是。或可能是。胎儿性别？男孩。分子生物学研究不是。寻找引起本病的原因不是。不进行产前基因诊断，但应研究家系中其他有风险者女孩。不进行分子生物学研究C50:C49:C45:C44:Cjp:11223C50:C49:C45:C44:Cjp:1221221313C50:C49:C45:C44:Cjp:2112121313C50:C49:C45:C44:Cjp:2112121313C50:C49:C45:C44:Cjp:2112112212C50:C49:C45:C44:Cjp:12212C50:C49:C45:C44:Cjp:21313C50:C49:C45:C44:Cjp:1122312212C50:C49:C45:C44:Cjp:21313C50:C49:C45:C44:Cjp:213131234567891011121314151617181920212223DMD家系分析125.82.83.40.9NNN4.84.85552.83.44.5NNNN4.84.855551234血友病Ａ家系分析间接诊断的不确定性遗传标志所带的信息性有限（多态性程度不高）新突变基因重组（若遗传标志离致病基因的遗传距离为5cM,此时基因重组的可能性为5%）家系成员不完整单基因病遗传缺陷的实验诊断

肢带型肌营养不良(LGMD2)是一类常染色体连锁隐性遗传病，已有LGMD2A~2H8种类型。由于遗传学和临床表现具高度异质性，临床诊断和分类十分困难家系资料致病基因的定位

用已报道的LGMD2A~2H8个基因所在位点附近共14个STR标记对家系成员DNA样本进行连锁分析，寻找与该家系连锁的致病基因

连锁基因标志位点基因位置LGMD2AD15S99415q15.1-15.3LGMD2AD15S778LGMD2AD15S779LGMD2BD2S3372p13LGMD