微生物学课件第2章 微生物的纯培养和显微技术

第二章微生物的纯培养和显微技术学时安排：2学时要求：1、掌握微生物的分离和培养技术2、了解显微镜和显微技术

第一节微生物的分离和纯培养一、无菌技术

概述（1）培养物：微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物。（2）纯培养物和纯培养的概念：微生物学中，将由一个细胞（或一种微生物）繁殖所得到的后代称为纯培养物。对微生物这种纯种的培养，称为微生物的纯培养。（3）无菌技术：在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其它微生物污染的技术称为无菌技术。常用器具：试管、玻璃烧瓶、平皿等器皿都要灭菌培养基：培养微生物营养物质。也要灭菌常用的灭菌方法：高压蒸汽灭菌微生物培养的常用器具及灭菌接种：在无菌条件下，用接种环把微生物从一个器皿转接到另一个器皿，叫做接种。接种方法：烧环—冷却—开管—沾菌和塞管—开另管—涂菌—塞另一管—火焰烧环（视频）接种操作二、用固体培养基分离纯培养菌落（CFU)的概念：由单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度后，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体叫菌落。菌落的大小、形状、边缘状况、质地、光泽、颜色及透明度等是微生物分类、鉴定的重要依据。菌苔：固体培养基表面众多菌落连成一片，呈片状，这就是菌苔。平板：即培养平板，指盛有固体培养基的平皿

在自然界中，各种各样的微生物总是混杂在一起的，要研究和利用某一微生物，就必须把它同其他微生物分开，才能得到只含有同一种微生物的纯种微生物。这种方法叫纯种微生物的分离纯种微生物的分离涂布平板法稀释到平板法平板划线分离法稀释插管法

纯种微生物的分离方法涂布平板法和稀释倒平板法

平板划线分离法

用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。三、用液体培养基分离纯培养稀释法：适用于原生动物和藻类的分离和培养四、单细胞分离显微分离法——单细胞分离法用毛细管提取单个原生动物个体用显微操作仪分离单个细菌五、选择培养分离

选择培养分离：根据微生物的营养、生理、生长条件等特点，通过选择培养进行微生物的分离与纯化技术称为选择培养分离。用选择培养基进行直接分离选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，以抑制非需要菌的生长，促进需要菌的生长，这种培养基叫选择培养基。高氏一号培养基加10%酚数滴，抑制其它菌的生长，分离出放线菌马丁氏培养基加链霉素以抑制其它菌生长，分离出真菌。富集培养根据不同微生物间特点制定特定的环境条件，使需要的微生物生长旺盛，数量增加。加富培养基：一般指在培养基内加入额外的营养物质，使需要的微生物营养更充分，生长的更快，这种培养基叫加富培养基。土悬液—培养基+硫磺—分离出硫杆菌土悬液—以羟基苯甲酸为唯一碳源的培养基——分离出能降解羟基苯甲酸的微生物。六、二元培养物纯培养物：只含有一种微生物的培养物叫做纯培养物。混合培养物：含有两种以上微生物的培养物叫做混合培养物。二元培养物:只含有二种微生物的培养物叫做二元培养物。例如寄生于细菌细胞内的病毒与细菌一起培养。七、微生物的保藏技术菌种保藏目的

给微生物一特定的条件，使其不污染、不改变特性而存活下来。菌种保藏原理

用人工方法降低微生物的代谢强度，限制微生物的生长和繁殖，使其处于休眠状态。传代培养保藏——隔绝空气低温保藏冷冻保藏——保护剂+菌种——零下196度速冻保存，或-70度冷冻室保存，-20~-30度普通冰箱冷冻室保存。干燥保藏——砂土管保存法和冷冻真空干燥保藏法纸片保藏法、薄脉保藏法、寄主保藏法等菌种保藏方法

第二节

显微镜和显微技术

决定显微观察效果的两个重要因素：分辨率：指能辨别两点之间最小距离的能力反差：指样品区别于背景的程度一、显微镜的种类及原理普通光学显微镜

光学显微镜的分辨率(最小分辨距)：

D=0.5λ/nsinθ

式中λ为光源波长；n为玻片到物镜介质的折射率；θ为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离。nsniθ叫作数值孔径。不同介质的折射率：空气为n=1.0；水n=1.33；香柏油n=1.55。因此，油镜的分辨率高。暗视野显微镜

暗视野显微镜利用特殊聚光器实现给样品斜射照明，由样品反射或折射的光再进入物镜，这样整个视野是暗的，只有样品是明亮的。主要用于观察生活细菌的运动性。暗视野和相差显微镜下的微生物(a)梅毒螺旋体(Treponema

pallidum),引起梅毒的螺菌；暗视野。(b)团藻属(Volvox)和水棉属(Spirogyra)的绿藻；暗视野。注意在成熟团藻菌落中形成的子菌落菌，及水棉属的螺旋状叶绿体。(c)迂回螺菌(Spirillum

volutans),具有束状鞭毛的一种个体很大的细菌。相差。(d)肉毒梭菌(Clostridum

botulinum),引起肉毒毒素中毒的细菌，它具有近端生卵形内生孢子；相差。(e)草履虫(Paramecium)染色后观察到的中央大核和在其边上的球形小核；相差。

相差显微镜

当光线通过标本时，由于直射光和衍射光的光程不同，就会是光波相位发生改变而产生相位差。相差显微镜具有环状光阑和相差板，能将光相位差转变为人的肉眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来的透明物体表现出明显的明暗差异。对比度增强。因此可以在不染色的情况下，观察到细胞的细微结构。荧光显微镜荧光：荧光素吸收紫外线会转放出可见光，这就是荧光荧光显微技术：把标本用不同的荧光素作标记，在荧光显微镜下，经过紫外线照射，标本会在黑暗背景下表现出有光亮的物体。使标本更便于观察。透射电子显微镜

用电子波代替光源，最短波长的可见光λ=450nm；而电磁波的波长最短可以达到λ=0.005nm。所以，电镜的分辨率远高于光学显微镜。扫描电子显微镜（SEM）

电子枪发出电子束被磁透镜会聚成极细的探针，在样品表面进行扫描，电子束探针扫描到的地方可以激发样品表面放出二次电子，二次电子的多少与样本表面的立体形状有关。二次电子由探测器收集并被闪烁器变成光信号，再经光电倍增管和放大器再编成电压信号来控制荧光屏上电子束的强度。扫描隧道显微镜（STM）

该显微镜有一个半径极细的金属探针，将探针的针尖与样品接近相距0.5—2nm时，进行扫描，此时再在探针和样品之间加上零点几伏的电压，会有纳安级的电流产生，这种电流就是隧道效应电流。通过电流变化来了解样品表面的形貌。二、显微观察样品的制备光学显微镜观察样品的制备活体观察：

压滴法、悬滴法、菌丝埋片法染色观察：

一般微生物个体小而无色透明，细胞结构的折光率与背景相差很小，在光学显微镜下，很难看清细胞的微细结构。通过对微生物染色，借助颜色的反衬作用，提高观察样品不同部位的反差，从而提高对细胞微细结构的观察效果。染色的一般步骤：涂片—干燥—固定—染色—水洗—干燥—镜检固定的目的:一是杀死细菌，二是使菌体粘附于玻片上，三是增加其对染料的亲和力。常用的固定方法有:火焰加热法和化学固定法。细菌的染色方法

1884年，由丹麦病理学家革兰创造并使用的一种能鉴别细菌的染色方法。染色过程:革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌革兰氏染色法甲菌乙菌结晶紫初染碘液媒染95%酒精脱色番红复染紫色红色载网：铜网、不锈钢载网支持膜：塑料膜、碳膜、金属膜负染色技术：用电子密度高、本身不显示其结构，而且不与样品反应的物质如磷钨酸钾对样品染色，可以清楚的衬托出样品表面结构。实际是让背景着色，使背景与标本产生较大反差。投影技术：在样品斜上方喷镀金属铂或铬，金属面散射电子能力强，表现为暗区，无喷涂面散射电子能力弱，表现为亮区。这样就可以了解样品的高度和立体形状。电子显微镜观察样品的制备透射电镜的样品制备超薄切片技术：标本需要制作成100纳米以下的超薄切片，方能看到内部结构。基本操作过程：取样—固定—脱水—浸透与包埋—切片—捞片—染色—观察

取样—脱水干燥——表面喷涂金属导电层扫描电镜的样品制备第三节

显微镜下的微生物微生物类型：细胞型和非细胞型两类细胞型微生物：细菌、古生菌、真核微生物非细胞型微生物：病毒、类病毒、朊病毒（见第三章）一、细菌和古生菌形态：球状—球菌，杆状—杆菌，螺旋状——螺菌和弧菌。排列：单个、成对、链状、成簇特殊形态的细菌如柄细菌有柄、菌丝、附器等球衣菌有衣鞘支原体无细胞壁，只有细胞膜，故柔软形态多变有些细菌不同生长阶段具有不同形态：如放线菌形成营养菌丝、气生菌丝和孢子丝。细菌的形态也受环境条件的影响，培养时间、培养温度等均能引起形态的改变。细菌的形态和排列球菌Staphylococcusaureus金黄色葡萄球菌Enterococcus

faecium屎肠球菌链球菌肺炎链球菌Streptococcuspneumoniae化脓链球菌Streptococcuspyogenes球菌细胞形态及

其分裂面的图解Esherichiacoli

大肠杆菌杆菌Bacillusanthracis

炭疽杆菌杆菌Pseudomonasaeruginosa

绿脓杆菌芽孢杆菌芽孢：细菌用来躲避不利环境的方式梭菌肉毒梭菌Clostridiumbotulinum破伤风梭菌Clostridiumtetani弧菌Vibrio

cholerae霍乱弧菌

螺旋体Borrelia

burgdorferi布氏疏螺旋体Treponema

pallidum苍白密螺旋体（梅毒密螺旋体）杆状细菌的排列方式常因生长阶段和培养条件而发生变化故难作为分类依据有纤毛和鞭毛的大肠杆菌大肠杆菌纤毛大肠杆菌鞭毛有鞭毛的杆菌柄细菌

古生菌与细菌有类似的形态，它们大多都生活在生存条件十分恶劣的极端环境里。如隐蔽热网菌是最耐热生物之一，它的最适生长温度为105度。古生菌的形态

古生菌的细胞形态图解球菌大小以直径表示；杆菌和螺旋菌以其长度和宽度表示。但是，经过干燥处理的菌体要比活菌缩短1/3——1/4；如果用衬托菌体的负染色法，器菌体可能比活菌还大。原核微生物的细胞大小

细菌大小测量微生物的表达单位为：

微米(µm=10-3mm)

纳米(nm=10-6mm)

o

埃(A

=10-7mm)

微生物界研究大小范围大致0.25~10µm(最大)0.75mm/50nm(最小)

=10~100亿(细菌间)真核微生物菌物界单细胞真菌---酵母菌丝状真菌-----霉菌大型真菌-----蕈菌粘菌假菌显微藻类原生生物二、真菌霉菌的菌丝霉菌霉菌：丝状真菌的总称菌丝体：许多菌丝交织在一起，形成菌丝体菌丝种类：无隔菌丝和有隔菌丝菌丝分化：营养菌丝、气生菌丝、繁殖菌丝霉菌的菌丝体霉菌大多酵母菌为单细胞以芽殖或裂殖进行无性繁殖酵母菌酵母菌的出芽生殖酿酒酵母的繁殖

－－出芽生殖三、藻类除蓝细菌、苔藓植物和维管束植物之外，有叶绿素，能够进行光合作用，并伴随释放氧气的一大类真核生物。藻类在供水系统长期存在可影响水质。如自来水有怪味。藻类在近海大量繁殖，可消耗大量氧气，引起大量的海洋生物死亡，这就是赤潮。放大200倍的斜纹藻四、原生动物原生动物是一类缺少真正细胞壁，细胞通常无色，具有运动能力，并进行吞噬营养的但细胞真核生物。如草履虫、变形虫等。第二章重点内容1、解释名词无菌技术：在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其它微生物污染的技术称为无菌技术。纯培养物和纯培养的概念：微生物学中，将由一个细胞（或一种微生物）繁殖所得到的后代称为纯培养物。对微生物这种纯种的培养，称为微生物的纯培养接种：在无菌条件下，用接种环把微生物从一个器皿转接到另一个器皿，叫做接种菌落的概念：由单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度后，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体叫菌落。菌苔：固体培养基表面众多菌落连成一片，呈片状，这就是菌苔。平板：即培养平板，指盛