酶工程学-第6周酶分离

第四章酶提取与分离纯化酶的提取（extraction）与分离（separation,isolation）纯化（purification）是将酶从细胞或其它含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所需酶的技术过程。第一节细胞破碎一、机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力，使组织细胞破碎的方法称为机械破碎法。1.机械捣碎法2.研磨法3.匀浆法二、物理破碎法通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法统称为物理破碎法。该方法多用于微生物细胞的破碎。1.温度差破碎法2.压力差破碎法3.超声波破碎法压力差破碎法超声波破碎法三、化学破碎法应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结构改变或破坏的方法。1.有机溶剂处理：利用有机溶剂可使细胞膜的磷质结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释放出胞外。2.表面活性剂处理：表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，增加膜的通透性。四、酶学破碎法在一定条件下，通过外加的酶或细胞本身存在的酶的作用，使细胞破碎。1.外加酶处理：根据细胞外层结构的特点，选用适当的酶，使细胞壁破坏，并在低渗透压的溶液中使细胞破裂。2.自溶法：将细胞在一定的pH和适宜的温度条件下保温一段时间，通过细胞本身存在的酶系将细胞破坏，使胞内物质释放出来的方法。G+：溶菌酶酵母：β－葡聚糖酶霉菌：几丁质酶植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶混合使用第二节酶的提取酶的提取：在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称作酶的抽提。1.盐溶液提取2.酸溶液提取：胰蛋白酶，0.12MH2SO43.碱溶液提取：L-天冬酰胺酶，pH11－12.54.有机溶剂提取：胆碱酯酶一、主要方法二、影响酶提取的主要因素1.温度：0－10℃2.pH3.提取液的体积：原材料的3－5倍4.添加保护剂：底物、辅酶、抗氧化剂第三节酶的提取过程中常用的技术离心是指借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术一、离心分离（一）离心机的种类及用途1.常速离心机：<8000r/min,<1x104g2.高速离心机：1x104——2.5x104r/min,1x104——1x105g3.超速离心机：2.5x104——8x104r/min,5x105g（二）离心方法的选择1.差速离心：采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。2.密度梯度离心：密度梯度的离心是样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质得以分离的一种区带分离方法。3.等密度离心：当欲分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，在离心力的作用下，不同浮力密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，一直移动到与它们各自浮力密度恰好相等的位置（等密度点），形成区带。也叫平衡等密度梯度。介质为CsCl,Cs2SO4,CsBr等（三）离心条件的确定1.离心力2.离心时间3.温度和pH离心力的转换列线图是通过改变某些条件，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀出来，达到与其他溶质分离的目的。

二、沉淀分离1.盐析沉淀法

2.等电点沉淀法

3.有机溶剂沉淀法

4.复合沉淀法疏水区域蛋白质分子上的电荷与疏水区蛋白质在等电点的溶解度最小pH与盐浓度对蛋白质溶解度的共同作用三、层析分离（一）什么是层析-chromatography利用混合物中个组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子特性、吸附力、分子亲和力和分配系数等）的不同，使各组分在两相中的分布程度不同而达到分离的目的。March21,1903,MeetingoftheWarsawSocietyofNaturalScientists,MikhailSemenovichTswettpresentedalectureentitled"OnaNewCategoryofAdsorptionPhenomenaanditsApplicationinBiochemicalAnalysis".

（二）层析是酶分离提纯的好手段疏水区域蛋白质分子上的电荷与疏水区蛋白质在等电点的溶解度最小pH与盐浓度对蛋白质溶解度的共同作用1.吸附层析

2.凝胶层析

3.离子交换层析

4.亲和层析（三）常用的层析方式1.凝胶层析又称分子筛层析，凝胶过滤或分子排阻层析，是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中个组分的相对分子质量不同而进行分离的技术。概念分配系数KaKa=(Ve-Vo)/V1Ve:洗脱体积Vo:外体积Vt:内体积2.亲和层析是利用生物分子对之间所具有的专一性而又可逆的亲和力使生物分子分离纯化的技术。配体：底物、竞争性抑制剂、辅酶3.离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同，而使不同物质分离的方法。离子交换剂的选择阴离子交换剂阳离子交换剂离子交换剂的处理（四）层析系统实验室用层析柱工业用层析柱0.5-5cm5-100cm带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。

四、电泳分离1.纸电泳

2.薄层电泳

3.凝胶电泳

4.等电聚焦电泳凝胶电泳以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持体的电泳技术。由于凝胶电泳同时具有电泳和分子筛的双重作用，故具有很高的分辨率。1.连续凝胶电泳

2.不连续凝胶电泳

3.浓度梯度凝胶电泳

4.SDS凝胶电泳SDS------------------------等电聚焦电泳是利用组分的等电点不同而进行分离的电泳技术。（1）两性电解质

（2）稳定pH梯度

（3）支持pH梯度的介质磷酸、硫酸+-NaOH1708年Reuss的实验1930年Tiselius的装置最早的电泳装置1948年分离血清蛋白的工作获得诺贝尔化学奖酶以晶体的形式从溶液中析出。

1.一定的纯度

2.一定的浓度

3.温度

4.pH

5.离子强度条件：1.盐析结晶法

2.有机溶剂结晶法

3.渗透平衡结晶法

4.等电点结晶法方法：五、酶的结晶六、酶的浓缩与干燥酶的浓缩：从低浓度酶液中除去部分的水或其他溶剂而成为高