凝胶色谱、亲和色谱研究进展及案例课件

主讲人：

CollegeofFoodScience,SCAU修德博学求实创新凝胶、亲和色谱目录近期中国色谱研究进展中国色谱研究进展中国色谱最新动态凝胶、亲和色谱案例分析凝胶过滤色谱亲和色谱一、近期中国色谱研究进展文章名：《近年中国色谱研究进展》作者：张祥民1、张丽华2、张玉奎2（2003年院士）作者单位：1.复旦大学2.中科院大连化物所发表期刊：《色谱》发表时间：2012年文章名：《近期色谱研究的最新动态和进展》作者：白泉作者单位：西北大学发表期刊：《色谱》发表时间：2015年色谱方法应用于化学领域的论文数量占46%，生物化学与分子生物学领域的占21%，食品科学与技术领域的占5%，材料科学、工程学、微生物学领域的各占4%，环境科学、光谱学和药理学领域的各占3%，上述领域之外的论文比例为8%。1990年至2010年，中国科学家所发表的色谱领域论文总数以28062篇的数量居世界第三位(第一名:美国，71008篇;第二名:日本，35035篇)。2010年发表论文4146篇，2011年发表4574篇，排名跃居世界第一。

涉及毛细管电泳（CE）、气象色谱（GC）高效液相色谱（HPLC）论文增长态势2、最新动态样品前处理膜蛋白的疏水性强、溶解性差和丰度低，对它的分离分析是蛋白质组学中的一大难题。复旦大学的刘宝红教授课题组采用壳聚糖改性的介孔泡沫石墨烯(MGF-CS)作为纳米反应器，从有机溶剂中高效富集疏水性膜蛋白并进行原位酶解。将该技术应用于实际样品中膜蛋白的分析鉴定，采用二维液相色谱－质谱方法(2D-LC-MS)可鉴定931种膜蛋白，而通常采用的水溶液中酶解法仅能鉴定73种膜蛋白。结果表明多功能的MGF-CS对蛋白质组学中膜蛋白的分析鉴定具有重要的应用价值。分子印迹技术是采用人工合成方法制备对目标分子有特异性识别材料的技术。由于蛋白质体积大、结构复杂、易于变性，完整蛋白质模板分子难以获得且价格昂贵，因此限制了蛋白质分子印迹材料的发展。中国科学院大连化学物理研究所张丽华研究员课题组提出了一种蛋白质抗原决定基分子印迹磁性纳米材料的制备新方法。抗原决定基印迹是以目标蛋白质上一段特异性多肽为模板分子进行印迹。由于模板肽段与目标蛋白质间存在极强的特异性，形成的印迹位点对模板肽段及目标蛋白质均具有特异性识别能力。金属有机骨架化合物（MOFs）因具有比表面积大、结构多样性、孔道尺寸可调、骨架可修饰、热稳定性和化学稳定性良好等优点而广泛应用于分离分析等领域。西班牙BalearicIslands大学的

Palomino课题组利用注射器设计了一种针管式自动磁性（MOFs）分散固相微萃取装置。固定相多孔整体材料作为一种新型分离介质，由于其具有制备简便、通透性好、性能稳定和易于修饰等特点而被誉为第四代色谱分离介质。邹汉法课题组发展了一种基于光引发巯基－丙烯酸酯点击聚合反应的新方法，并成功制备了具有高分离性能的有机－硅胶杂化整体柱。与巯基－烯和巯基－甲基丙烯酸酯点击聚合反应相似，光引发的巯基－丙烯酸酯点击聚合反应不仅反应效率较高，速度快，而且反应条件非常温和。加拿大卡尔加里大学的Thurbide小组将316不锈钢粉末（粒径44~149μm）填充于316不锈钢毛细管柱内作为支持体，将水泵入色谱柱中，建立了以水为固定相，CO2为流动相，与火焰离子化检测器联用的超临界流体色谱分离体系（SFC-FID）。二、凝胶、亲和色谱案例分析1、凝胶过滤色谱（凝胶色谱分为凝胶过滤色谱和凝胶渗透色谱）文章名：《凝胶过滤色谱法测定婴儿配方乳粉中α-乳白蛋白》作者：贾云虹，宋晓青，杨凯作者单位：河北省三元食品有限公司发表期刊：《食品科技》发表时间：2015年《食品科技》（FoodScienceandTechnology）1975年创刊，北京市粮食科学研究所主办，1996-2011年连续5届中文核心期刊。背景α-乳白蛋白中富含色氨酸，色氨酸是人体必需氨基酸之一。食用α-乳白蛋白和食用酪蛋白的结果相比，大脑中的色氨酸含量比例高达48%，且减弱了中性氨基酸和色氨酸在穿过血脑屏障时的竞争。这些依据表明，在婴儿配方乳粉中加入富含色氨酸的α-乳白蛋白，使其接近母乳中α-乳白蛋白的含量比例，是非常必要的。牛乳母乳80%酪蛋白+20%乳清蛋白60%乳清蛋白α-乳白蛋白浓度1.0~1.5g/L，占清蛋白的20%α-乳白蛋白是母乳清蛋白的主要成分，在成熟母乳中(30d后)的浓度为(2.44±0.64)g/Lα-乳白蛋白检测方法方法优点缺点聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)普适性最强操作复杂，测定周期长，重现性差，只能半定量。反相高效液相色谱(RP-HPLC)快速高效精准、重现性稳定只能检测出天然的α-乳白蛋白离子交换液相色谱(FPLC)快速高效精准需要预先把要乳清蛋白与酪蛋白分离才可以进行毛细管凝胶电泳(CGE)定量分析可靠蛋白质容易在石英毛细管上吸附，影响分离效率，甚至堵塞毛细管柱液相色谱-质谱联用(LC-MS)灵敏度高、稳定性好只能检测非变性的α-乳白蛋白实验方法准确称取含有大约相当于10mg蛋白质的样品，样品溶在盛有流动相溶液的10mL容量瓶中，超声处理30min。从以上样品中转移1.5mL于10mL离心管中，加入10μLβ-硫基乙醇，摇动混合约10s，让样品在室温下放置至少2h，用0.45μm微孔滤膜过滤至液相色谱进样瓶中，然后注射进液相色谱。根据标样峰面积和浓度建立标准曲线，从而计算样品中α-乳白蛋白含量。选择色谱柱α-乳白蛋白的相对分子质量为14200u，而凝胶色谱柱TSK-2000SWXL分离样品的相对分子质量范围为5000~150000u，因此选择此色谱柱是比较合适的。组成蛋白质的氨基酸在210~280nm范围内都有不同程度的吸收，但只有色氨酸在280nm有足够高的吸收，而α-乳白蛋白含有丰富的色氨酸，因此选择280nm作为DAD的检测波长，能获得较好的灵敏度。回归方程和检出限称取适量α-乳白蛋白标准品，用流动相配制成0.1、0.2、0.3、0.4mg/mL的标准系列，按照1.3所述色谱条件进行测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，做标准曲线，得到α-乳白蛋白线性回归方程：Y=8407.6X-90.26，线性相关系数：R2=0.9998。以信噪比S/N=3计算α-乳白蛋白的检测限为2.8μg/mL，完全能满足婴儿配方乳粉中α-乳白蛋白含量的测定。婴儿配方乳粉中α-乳白蛋白含量的测定2、亲和色谱文章名：《亲和色谱应用于天然活性成分筛选的研究进展》作者：冯颖淑1，童珊珊2，徐希明2等作者单位：1中国药科大学2江苏大学发表期刊：《中国中药杂志》发表时间：2015年亲和色谱法筛选技术受体为亲和配基的色谱筛选酶为亲和配基的色谱筛选血浆蛋白为亲和配基的色谱筛选以DNA为亲和配基的色谱筛选细胞膜色谱筛选脂筏色谱筛选分子印迹技术其他亲和配基（如核酸适配体亲和色谱、免疫亲和色谱、金属离子亲和色谱等等。）文章名：《壳聚糖螯合凝胶层析法纯化血液超氧化物歧化酶》作者：王保，全平娟，张永州等作者单位：河南大学，中科院生物物理研究所，兰州大学发表期刊：《食品与生物技术学报》发表时间：2014年研究背景超氧化物歧化酶简称SOD，是广泛存在于生物体内的一种可防止氧化损伤和缺失的活性酶，也是一种应用广泛的药用酶，具有抗衰老、预防辐射及治疗炎症等一系列功能，已经被广泛应用于食品及医药卫生行业。1975年proath首次提出固定化金属螯合亲和层析（IMAC），利用固定在基质上的过渡态金属离子和蛋白质表面的组氨酸、半胱氨酸、色氨酸等残基的配位作用，来实现对金属离子有亲和力的蛋白质的吸附和分离。在制备亲和介质时，常用的金属离子有Cu2+，Zn2+和Ni2+等，常用的螯合配基有亚氨基二乙酸（IDA），三羧基甲基乙二胺（TED），次氨基三乙酸（NTA）等。固定化螯合亲和色谱常常以凝胶为载体，如在SephadexG-75或者DEAE-superpose等凝胶上用化学交联方法引入螯合剂IDA，再通过交联固定和亲和配（Ba2+，Cu2+，Zn2+）。用该方法制备的凝胶介质生产成本很高，软基质很易被压缩，不易被放大生产。近年来，随着基因工程下游技术的发展，基因重组蛋白质的分离纯化技术越来越显示其重要性，金属螯合层析技术（IMAC）分辨率高、选择性好，能在常规的变性条件下及非变性条件下进行蛋白质组分分离纯化。