第十八章高效液相色谱法

第十八章高效液相色谱法HPLC1经典液相色谱法为基础;引入气相色谱法的理论和实验技术;高压输送流动相;高效固定相及高灵敏度检测器;现代液相色谱分析方法。2与经典液相色谱法相比

颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相，(键合相)传质阻抗小，柱效高，分离效率高；高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达109g，而荧光检测器最小检测限可达1012g。

3与气相色谱法相比不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广；可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选择性有很大作用，选择性高；一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。4第一节高效液相色谱法的主要类型和原理

一、主要类型 四类基本类型色谱法

分配色谱法（partitionchromatography）吸附色谱法（adsorptionchromatography）离子交换色谱法（IEC）分子排阻色谱法（SEC）化学键合相色谱法5二、化学键合相色谱法

以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法(bondedphasechromatography；BPC)化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相6优点：固定相的均一性和稳定性好，在使用过程中不易流失，使用周期长；柱效高；重现性好；能使用的流动相和键合相的种类多，分离的选择性高正相（normalphase，NP）和反相（reversedphase，RP）键合相色谱法：根据化学键合相与流动相极性的相对强弱7（一）正相键合相色谱法

固定相：极性键合相如氰基（－CN）、氨基（－NH2）或二羟基键合硅胶。（经典：水饱和的硅胶）流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调整剂如烷烃加醇类。（与水不混溶的溶剂）适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物8正相键合相色谱法分离选择性：极性强的组分k大，后洗脱出柱。流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小，tR减小。分离机制：分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用9（二）反相键合相色谱法固定相：非极性键合相如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）键合硅胶流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂常用甲醇－水、乙腈－水等应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有有机酸、碱及盐等）10保留机制疏溶剂理论（solvophobictheory）溶质的保留主要是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。不是溶质分子与键合相间的色散力，11保留行为的主要影响因素1、溶质的分子结构（极性）极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。 同系物碳数越多，极性越弱，k越大； 引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。2、固定相键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的k也增大。硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大。123、流动相极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂溶剂比例：水的比例增加，使k增大中性盐的加入：使中性溶质的k增大pH：影响弱酸、弱减的离解 流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱碱k变小。13离子抑制色谱法（ionsuppressionchromatography；ISC）用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相的pH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏水缔合作用，使k变大。适用于3≤pKa≤7的弱酸、7≤pKa≤8的弱碱14把离子对试剂加入到含水流动相中，被分析的组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子（或称对称离子，counterion）生成不荷电的中性离子对，从而增加溶质与非极性固定相的作用，使分配系数增加，改善分离效果。用于分离可离子化或离子型化合物。（三）反相离子对色谱法

pairedionchromatography；PIC

ionpairchromatography；IPC15离子对模型固定相Bm++Am-↔（B+·A-）m↔（B+·A-）s流动相通式+(BH+·RSO3-）mB+H+↔BH+RSO3Na↔RSO3-+Na+离子对(BH+·RSO3-）s16影响保留因子的因素离子对试剂的种类和浓度：在反相离子对色谱中，离子对试剂碳链长度增加，溶质的k增大；在一定范围内试剂的浓度升高，溶质的k增大流动相的pH：有利于组分和离子对试剂离子化时（离子对的形成），组分的k值最大固定相、流动相性质（同一般RP-HPLC）。17适用范围：有机酸、碱、盐，离子型和非离子型化合物的混合物。分析酸类或带负电荷物质：用季铵盐，如四丁基铵磷酸盐（TBA）和溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）等分析碱类或带正电荷的物质：用烷基磺酸盐或硫酸盐，如正戊烷基磺酸钠（PICB5）、正己烷基磺酸钠（PICB6）、正庚烷基磺酸钠（PICB7）。

适用范围和离子对试剂的选择18三、其他高效液相色谱法

（一）离子色谱法

离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。离子色谱法可分为两大类：抑制型（双柱型）和非抑制型（单柱型）以分析阴离子X-为例：分离柱：填有低交换容量的阴离子交换剂抑制柱：填有高交换容量的阳离子交换剂（称为阴离子抑制柱）。19两柱上的反应：分离柱：交换反应：R+-OH-+NaX→R+-X-+NaOH洗脱反应：R+-X-+NaOH→R+-OH-+NaX抑制柱：与组分反应：R--H++NaX→R--Na++HX与洗脱剂反应:R--H++NaOH→R--Na++H2O20(二）手性色谱法手性色谱法是利用手性固定相或手性流动相添加剂分离分析手性化合物的对映异构体的色谱法。间接法分析手性化合物的对映体，即将试样与适当的手性试剂(单一对映体)反应，使其一对对映异构体转变为非对映异构体，然后用常规HPLC方法分离分析。21实现手性拆分的基本原理是对映异构体与手性选择物(固定相或添加剂)形成瞬间非对映立体异构“配合物”，由于两对映异构体形成的“配合物”的稳定性不同，因而得到分离。手性固定相的种类繁多，它们与对映体的作用力也各有个同。如π-氢键型固定相与手性化合物之间一般认为有3种作用力，即π-π相互作用、氢键作用和偶极间相互作用，化合物与固定相之间的作用部位至少有一个受对映体立体构型的影响。22

（三）亲和色谱法（AC）

亲和色谱是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力，进行选择性分离的一种方法。它通常是在载体（无机或有机填料）表面先键合一种具有一般反应性能的所谓间隔臂（如环氧、联氨等）；随后，再连接上配基（酶、抗原或激素等）。23第二节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择固定相应符合下列要求：颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压；化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。24一、化学键合相色谱法的固定相（一）键合相的种类非极性键合相：非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表面；用于反相色谱；长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高，稳定性更好。25弱极性键合相：醚基和二羟基等键合相用于反相或正相色谱极性键合相：常用氨基﹑氰基键合相（氰乙硅烷基≡Si(CH2)2CN)键合硅胶一般用于正相色谱特殊用途的键合相26（二）键合相的性质和特点

键合反应硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应

如：YWG－C18H37，无定形硅胶YWG上键合了十八硅烷基；SpherisorbODS，球形硅胶Spherisorb上键合了ODS。27键合相的性质含碳量：含碳的百分数覆盖度：已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例封尾（end-capping）：在键合反应后，用三甲基氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。28键合相的特点使用过程中不流失；化学稳定性好；适于梯度洗脱；载样量大注意：流动相的pH一般应在2-8，否则会引起硅胶溶解；不同厂家，不同批号的同一类型键合相也可能表现不同的色谱特性。29二、化学键合相色谱法的流动相

对流动相的要求：与固定相不发生化学反应。对试样有适宜的溶解度，使k在1~10范围内。与检测器相适应。纯度高，粘度小。30（一）流动相对分离的影响n由色谱柱（固定相）性能决定，α主要受溶剂种类的影响，k受溶剂配比的影响。增加流动相中强溶剂的比例，其洗脱能力增强，使k变小。31（二）流动相的强度和选择性溶剂的极性（强度）正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强溶剂的选择性不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同混合溶剂（二元或多元流动相）32溶剂极性参数：表示溶剂与乙醇、二氧六环、硝基甲烷相互作用纯溶剂的极性参数P′P′=lg（Kg″)e+lg(Kg″)d+lg(Kg″)nKg″极性分配系数P′越大，溶剂的极性越强，在正相色谱中的洗脱能力越强。强度因子反相色谱中的溶剂强度用强度因子S表示。反相色谱中，S大的溶剂洗脱能力强。33混合溶剂的强度溶剂的选择性Xe、Xd、Xn分别反映溶剂的质子接受能力、质子给予能力和偶极作用力3435三、分离条件的选择（一）HPLC中的速率理论H=A+B/u+Cu涡流扩散A=2λdp

球形、小粒度、均匀（RSD＜5%）固定相，匀浆高压填充，以降低A。纵向扩散B=2γDm可以忽略。因为Dl很小，室温操作，且U大于U最佳，36传质阻抗固定相传质阻抗CS可以忽略，因df极小流动相传质阻抗Cm

要求：dp小，Dm大静态流动相传质阻抗：由于部分流动相在固定相微孔内的滞留静态流动相传质阻抗系数Csm

Csm∝dp2，Csm∝1/Dm，而Dm∝T/η

要求:固定相dp2、流动相η都小37

H=A+Cmu+Csmu原因：化学键合相，液体流动相结果：HPLC的实验条件应该是：①小粒度、均匀的球形化学键合相；②低粘度流动相，流速不宜过快；③柱温适当。HPLC中的速率理论38（二）正相键合相色谱法的分离条件

固定相极性键合相如氰基、氨基键合相等分离含双键的化合物常用氰基键合相，分离多基团化合物常用氨基键合相。流动相烷烃加适量极性调节剂39（三）反相键合相色谱法的分离条件

固定相非极性键合相如ODS流动相以水为基础溶剂，加入甲醇、乙腈等极性调节剂弱酸、弱碱或缓冲盐作为离子抑制剂加入0.1%∽1%的醋酸盐、磷酸盐可减少残余硅醇基的作用40（四）反相离子对色谱法的分离条件

固定相 尽可能选择表面覆盖度高且疏水性强的非极性键合相，离子对试剂 离子对试剂所带的电荷应与试样离子的电荷相反流动相pH使试样组分与离子对试剂全部离子化有机溶剂及其浓度同一般HPLC41第三节高效液相色谱仪组成输液系统进样系统色谱柱系统检测系统数据记录处理系统4243一、输液系统（1）高压输液泵恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。常用柱塞往复泵双泵：为了克服流量的脉动。有串联式和并联式44来自流动相454647输液泵应具备的性能：流量精度高且稳定流量范围宽能在高压下连续工作液缸容积小密封性能好，耐腐蚀输液泵操作注意事项：防止固体微粒进入泵体流动相不应含有腐蚀性物质防止溶剂瓶内的流动相被用完不超过规定的最高压力流动相一般应该先脱气48（2）梯度洗脱装置在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。

液相色谱中通常所说的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。49

线性梯度：在某一段时间内连续而均匀增加流动相强度。

阶梯梯度：直接从某一低强度的流动相改变为另一较高强度的流动相。梯度洗脱时，流动相的输送就是要将几种组成的溶液混合后送到分离系统，因此，梯度洗脱装置就是解决溶液的混合问题，其主要部件除高压泵外，还有混合器和梯度程序控制器。根据溶液混合的方式可以将梯度洗脱分为高压梯度和低压梯度。50

高压梯度：一般只用于二元梯度，即用两个高压泵分别按设定的比例输送A和B两种溶液至混合器，混合器是在泵之后，即两种溶液是在高压状态下进行混合的。51

低压梯度：只需一个高压泵，与等度洗脱输液系统相比，就是在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。52二、分离和进样系统

进样器进样阀（六通阀）、自动进样装置色谱柱（column）由柱管和固定相组成分析柱、制备柱性能评价H、n、fs、k和α的重复性，或R。

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色谱填料：经过制备处理后，用于填充色谱柱的物质颗粒，通常是5-10μm粒径的球形颗粒。

色谱柱管：内部抛光的不锈钢管。典型的液相色谱分析柱尺寸是内径4.6mm，长250mm。

色谱柱：也称固定相，是将色谱填料填充到色谱柱管中所构成的。5455三、检测系统

检测器：用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。检测器利用溶质的某一物理或化学性质与流动相有差异的原理，当溶质从色谱柱流出时，会导致流动相背景值发生变化，从而在色谱图上以色谱峰的形式记录下来。56（一）检测器(detector)的主要性能要求：灵敏度（sensitivity）高（检测限低）噪音（noise）低线性范围（linearrange）宽重复性（repeatability）好适用范围广（通用型、专属型）57（二）紫外检测器(ultravioletdetector)

检测原理：朗伯－比尔(Lambert-Beer)定律，响应信号（吸光度）与浓度成正比A=εCl特点：灵敏度较高（10-6—10-9g/ml），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应用广（分析、制备）。局限：专属型、浓度型检测器只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。58固定波长检测器：254nm可变波长检测器：光源：氘灯（和钨灯），200—400（800）nm，单色器，流通池（试样），光电管光路系统和紫外分光光度计相似光电二极管阵列检测器(photodiodearraydetector；PDAD)：一系列光电二极管，一个二极管对应接受光谱上约1nm谱带宽的单色光59光电二极管阵列检测器工作原理：复光通过流通池，再进入单色器，分光后照射在二极管阵列装置上，同时获得各波长的信号强度，即获得组分的吸收光谱。获得三维光谱－色谱图。用途：吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用于定量,判断峰纯度。606162（三）荧光检测器(fluorescencedetector；FD)检测原理：荧光强度(F)与激发光强度(I0)及荧光物质浓度(C)之间的关系为：F=2.3QKI0εCl

Q为量子产率，K为荧光效率，ε为摩尔吸光系数，l为光径长度。F=KC

特点：选择性好，专属型检测器灵敏度比紫外检测器高（检测限10-10g/ml）激发波长(ex)和发射波长(em)的选择6364（四）安培检测器安培检测器安培检测器的灵敏度很高，尤其适用于痕量组分的分析，凡具有氧化还原活性的物质都能进行检测，本身没有氧化还原活性的化合物经衍生化后，也能进行检测。安培检测器的工作原理：在电极间施加一恒定电位，当电活性组分经过电极表面时，发生氧化还原反应，产生电量（Q）的大小符合法拉第定律：Q=nFN。反应的电流：65（五）蒸发光散射检测器

适用于挥发性低于流动相的组分，主要用于检测糖类、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、三酰甘油及甾体。66第四节高效液相色谱分析方法

一、定性分析方法1．色谱鉴定法利用色谱定性参数保留时间(或保留体积)和相对保留值或用已知物对照法对组分进行鉴别分析，其原理是同一物质在相同色谱条件下保留时间相同。此法只能对范围已知的化合物进行定性。6